Давхар хэлхээтэй РНХ (dsRNA) ELISA KIT

Энэхүү иж бүрдэл нь дараалалаас үл хамааран 60 үндсэн хосоос (bp) дээш урттай dsRNA-ийн тоон хэмжилтэнд зориулагдсан биотин-Стрептавидин системтэй ферменттэй холбоотой иммуносорбентын шинжилгээ (ELISA) юм.Уг хавтанг анти-dsRNA эсрэгбиеээр урьдчилан бүрсэн байна.Дээжинд байгаа dsRNA-г нэмж, цооног дээр бүрхэгдсэн эсрэгбиетэй холбогддог.Дараа нь биотинжүүлсэн анти-dsRNA эсрэгбие нэмж, дээж дэх dsRNA-тай холбогддог.Угаалгын дараа HRP-Стрептавидин нэмж, биотинжуулсан анти-dsRNA эсрэгбиетэй холбогддог.Инкубацийн дараа холбоогүй HRP-стрептавидиныг угаана.Дараа нь TMB субстратын уусмалыг нэмж, HRP-ээр катализаж, хүчиллэг зогсоох уусмал нэмсний дараа шар болж хувирсан цэнхэр өнгийн бүтээгдэхүүнийг гаргана.Шар өнгөний нягтрал нь хавтан дээр баригдсан dsRNA-ийн зорилтот хэмжээтэй пропорциональ байна.Гэрэл шингээлтийг 450 нм-д хэмждэг.

Өргөдөл

Энэхүү хэрэгсэл нь үлдэгдэл dsRNA-ийн тоон хэмжилтэд зориулагдсан.

Иж бүрдэл хэсгүүд

Хадгалалт ба тогтвортой байдал

1. Ашиглагдаагүй иж бүрдэлд: Хадгалах хугацаандаа иж бүрдлийг 2~8℃ хэмд бүхэлд нь хадгалах боломжтой.Хадгалах тогтвортой байдлыг хангахын тулд хүчтэй гэрлээс зайлсхийх хэрэгтэй.

2. Ашигласан иж бүрдэлд: Бичил хавтанг онгойлгосны дараа ашиглагдаагүй худгийг хавтан битүүмжлэгчээр таглаж, чийгшүүлэгч савыг агуулсан тугалган уутанд буцаж, тугалган уутыг зипээр битүүмжилж, хэрэглэсний дараа аль болох хурдан 2~8℃ температурт буцаана уу.Бусад урвалжуудыг хэрэглэсний дараа аль болох хурдан 2~8℃ температурт буцаана.

Шаардлагатай боловч нийлүүлээгүй материал

1. 450±10нм шүүлтүүртэй микропластин уншигч (450 ба 650 нм долгионы уртыг илрүүлж чадвал илүү дээр).

2. Микропластин сэгсэрч.

3. RNase агуулаагүй үзүүр ба центрифугийн хоолой.

Үйлдлийн схем

Эхлэхээс чинь өмнө

1. Хэрэглэхийн өмнө бүх иж бүрдэл хэсгүүд болон дээжийг тасалгааны температурт (18-25℃) авчирна.Хэрэв иж бүрдэл нэг удаад дуусахгүй бол зөвхөн туршилтын тууз, урвалжийг гаргаж аваад үлдсэн тууз, урвалжийг шаардлагатай нөхцөлд үлдээнэ үү.

2. Угаах буфер: 40 мл 20 × концентрацитай угаалгын буферийг 760 мл ионгүйжүүлсэн эсвэл нэрмэл усаар шингэлж 800 мл 1 × угаалгын буфер бэлтгэнэ.

3. Стандарт: хэрэглэхийн өмнө уусмалыг богино хугацаанд эргүүлэх буюу центрифуг хийнэ.Дөрвөн стандартын агууламж 5нг/мкл байна.UTP болон pUTP dsRNA стандартын хувьд стандарт муруйг зурахын тулд нөөцийн уусмалыг 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL хүртэл STE буферээр шингэлнэ.N1-Me-pUTP dsRNA стандартын хувьд стандарт муруйг зурахын тулд нөөцийн уусмалыг 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL хүртэл шингэлж, STE буферт оруулна.5-OMe-UTP dsRNA стандартын хувьд стандарт муруйг зурахын тулд нөөцийн уусмалыг 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg/μL хүртэл шингэлж, STE буферт оруулна.Стандартуудыг дараах графикаар шингэлэхийг зөвлөж байна.

4. Биотинжуулсан илрүүлэгч эсрэгбие ба HRP-стрептавидины ажлын уусмал: хэрэглэхийн өмнө уусмалыг богино хугацаанд эргүүлэх буюу центрифуг хийнэ.Тэдгээрийг шингэлэх буферээр ажлын концентраци хүртэл шингэлнэ.

5. TMB дэд төлөв: уусмалын шаардлагатай тунг ариутгасан үзүүрээр соруулж, уусмалын үлдэгдлийг дахин шилэнд бүү асга.TMB дэд төлөв гэрэлд мэдрэмтгий тул TMB субстратыг удаан хугацаагаар гэрэлд бүү байлга.

Протокол ашиглах

1. Шинжилгээнд шаардагдах туузны тоог тодорхойлно.Ашиглахын тулд туузыг хүрээ дотор оруулна.Энэ шинжилгээнд ашиглагдаагүй үлдсэн хавтангийн туузыг чийг шингээгчтэй уутанд хийж дахин савлана.Хөргөгчинд хадгалахын тулд уутыг сайтар хаа.

2. Стандарт, хоосон зай, дээжийн шингэрүүлэлт тус бүрээс 100 мкл-ийг тохирох нүхэнд хийнэ.Хавтангийн чигжээсээр хучих.Өрөөний температурт 1 цагийн турш 500 эрг/мин хурдтайгаар сэгсэрнэ.Нарийвчлалтай шинжилгээ хийхийн тулд дээжийг зохих концентраци хүртэл STE буферээр шингэлнэ.

3. Угаах үе шат: Уусмалыг соруулж, нүх тус бүрт 250μL угаах буферээр угааж, 30 секунд байлгана.Уг хавтанг шингээгч цаасан дээр нааж угаах буферийг бүрэн устгана.Нийтдээ 4 удаа угаана.

4. Цооног бүрт 100μL биотинжүүлсэн илрүүлэх эсрэгбиений ажиллах уусмал нэмнэ.Хавтангийн чигжээсээр хучих.Өрөөний температурт 1 цагийн турш 500 эрг/мин хурдтайгаар сэгсэрнэ.

5. Угаах алхамыг давтана уу.

6. Худаг тус бүрт 100мкл HRP-стрептавидины ажлын уусмал нэмнэ.Хавтангийн чигжээсээр хучих.Өрөөний температурт 30 минутын турш 500 эрг / мин-д сэгсэрнэ.

7. Угаах алхамыг дахин давтана уу.

8. Худаг бүрт 100μL TMB субстратын уусмал нэмнэ.Хавтангийн чигжээсээр хучих.RT-д 30 минутын турш өсгөвөрлөнө Гэрэлээс хамгаална.Субстратын уусмал нэмснээр шингэн нь цэнхэр өнгөтэй болно.

9. Цооног бүрт 50мкл зогсоолын уусмал хийнэ.Шингэнийг зогсоох уусмал нэмснээр шар өнгөтэй болно.Дараа нь микропластин уншигчийг ажиллуулж, нэн даруй 450 нм хэмжилт хийнэ.

Үр дүнгийн тооцоо

1. Стандарт, хяналт, дээж тус бүрийн давхардсан уншилтыг дундажлаж, дундаж тэг стандарт оптик нягтыг хасна.Босоо(Y) тэнхлэгт шингээх чадвар, хэвтээ(X）тэнхлэгт dsRNA концентрацитай стандарт муруйг байгуул.

2. Тооцооллыг 5 эсвэл 4 параметрийн шугаман бус загварт curve expert 1.3 эсвэл ELISA Calc зэрэг компьютерт суурилсан муруй тохируулагч программ хангамжаар хийхийг зөвлөж байна.

Гүйцэтгэл

1. Мэдрэмж:

илрүүлэх доод хязгаар: ≤ 0.001pg/μL (UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA-ийн хувьд), ≤ 0.01pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA-ийн хувьд).

хэмжилтийн доод хязгаар:0.0156 pg/μL (UTP-, pUTP-dsRNA-ийн хувьд), 0.0312 pg/μL (N1-Me-pUTP-dsRNA-ийн хувьд), 0.0625 pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA-ийн хувьд).

2. Нарийвчлал: Intra-Assay CV ≤10%, Inter-Assay CV ≤10%

3. Сэргээх: 80%~120%

4. Шугаман чанар: 0.0156-0.5pg/μL(forUTP-,pUTP-dsRNA)0.0312-1pg/μL(forN1-Me-pUTP dsRNA),0.0625-1pg/μL (5-OMe-UTP-dsRNA-д).

Анхаарах зүйл

1. TMB урвалын температур ба цаг нь маш чухал тул зааврын дагуу хатуу хяналт тавина.

2. Шинжилгээний сайн давтагдах чадвар, мэдрэмтгий байдалд хүрэхийн тулд илүү их урвалд ороогүй урвалжуудыг зайлуулахын тулд ялтсуудыг зөв угаах нь чухал юм.

3. Хэрэглэхийн өмнө бүх урвалжуудыг сайтар хольж, дээж эсвэл урвалж нэмэх явцад хөөс үүсэхээс сэргийлнэ.

4. Төвлөрсөн угаалгын буферт (20х) талст үүссэн бол 37℃ хүртэл халааж, талстууд бүрэн уусах хүртэл зөөлөн холино.

5. Натрийн азид (NaN3) агуулсан дээжийг шинжлэхээс зайлсхий, учир нь энэ нь HRP-ийн идэвхийг устгаж, dsRNA-ийн хэмжээг дутуу үнэлэхэд хүргэдэг.

6. Шинжилгээний явцад RNase-ийн бохирдлоос зайлсхийх.

7. Стандарт/дээж, илрүүлэх эсрэгбие болон SA-HRP-ийг мөн сэгсрэхгүйгээр RT-д хийж болох боловч энэ нь илрүүлэх мэдрэмжийг нэг дахин бууруулж болзошгүй.Энэ тохиолдолд UTP болон pUTP dsRNA стандартыг 2pg/μL, N1-Me-pUTP dsRNA стандартыг 4pg/μL, 5-OMe-UTP dsRNA стандартыг 8pg/μL-ээс шингэлэхийг зөвлөж байна.Үүнээс гадна HRP-стрептавидины ажлын уусмалыг тасалгааны температурт 60 минутын турш өсгөвөрлөнө.Колбоны сэгсрэгчийг бүү ашигла, учир нь колбонд сэгсэрснээр үр дүн нь буруу байж болзошгүй.

Ердийн үр дүн

1. Стандарт муруй өгөгдөл

2. Стандарт муруй тооцоо

3. Доторлогоо илрүүлэх хүрээ:0.0312- 1pg/μL