Протеиназа К (лиофилжсэн нунтаг)
Муурын дугаар: HC4500A
Proteinase K нь өргөн субстратын өвөрмөц шинж чанартай тогтвортой серин протеаз юм.Энэ нь угаалгын нунтаг байгаа ч гэсэн төрөлх төлөв байдалд олон уургийг задалдаг.Кристал болон молекулын бүтцийн судалгаагаар фермент нь идэвхтэй талбайн каталитик гурвал (Asp) бүхий субтилизин гэр бүлд хамаардаг болохыг харуулж байна.39- Түүний69- Сэр224).Хагарлын зонхилох газар нь блоклогдсон альфа амин бүлгүүдтэй алифат болон үнэрт амин хүчлүүдийн карбоксил бүлгийн зэргэлдээ пептидийн холбоо юм.Энэ нь өргөн хүрээний хувьд ихэвчлэн ашиглагддагөвөрмөц байдал.
Хадгалах нөхцөл
2-8℃ богино хугацааны хадгалалт, -25~-15℃ урт хугацааны хадгалалт.Хуурай нунтаг байдал -25~-15℃ 3 жилийн хугацаанд хүчинтэй;ферментийн нунтагыг зохих хэмжээгээр уусгана.
Тодорхойлолт
| Гадаад төрх | Цагаан, цагаан өнгөтэй аморф лиофилжсэн нунтаг |
| Үйл ажиллагаа | ≥30 U/мг |
| ДНаз | Аль нь ч илрээгүй |
| RNase | Аль нь ч илрээгүй |
Үл хөдлөх хөрөнгө
| EC дугаар | 3.4.21.64 (Tritirachium цомгийн рекомбинант) |
| Молекулын жин | 29 кДа (SDS-PAGE) |
| Изоэлектрик цэг | 7.81 |
| Хамгийн оновчтой рН | 7.0-12.0 Зураг 1 |
| Хамгийн оновчтой температур | 65 ℃ Зураг 2 |
| рН-ийн тогтвортой байдал | рН 4.5-12.5 (25℃, 16 цаг) Зураг 3 |
| Дулааны тогтвортой байдал | 50℃-аас доош (рН 8.0, 30мин) Зураг 4 |
| Идэвхжүүлэгчид | SDS, мочевин |
| Дарангуйлагчид | Диизопропил фторфосфат;фенилметилсульфонил фтор |
Хэрэглээ
1. Генетикийн оношлогооны иж бүрдэл
2. РНХ ба ДНХ олборлох иж бүрдэл
3. Эд эсээс уургийн бус бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг гаргаж авах, ДНХ-ийн вакцин зэрэг уургийн хольцыг задлах, гепарин бэлтгэх
4. Импульсийн электрофорезийн аргаар хромосомын ДНХ бэлтгэх
5. Баруун толбо
6. In vitro оношлогоонд ферментийн гликозилжүүлсэн альбумин урвалжууд
Урьдчилан сэргийлэх
Ашиглах, жинлэх үед хамгаалалтын бээлий, нүдний шил зүүж, хэрэглэсний дараа агааржуулалт сайтай байлгана.Энэ бүтээгдэхүүн нь арьсны харшлын урвал, нүдийг цочрооход хүргэдэг.Хэрэв амьсгалсан бол харшил, астма, амьсгал давчдах шинж тэмдэг илэрч болно.Амьсгалын замын цочрол үүсгэж болзошгүй.
Шинжилгээ
Нэгжийн тодорхойлолт
Нэг нэгж (U) нь дараах нөхцлүүдийн дагуу минутанд 1 мкмоль тирозин үүсгэхийн тулд казеиныг гидролиздэхэд шаардагдах ферментийн хэмжээг хэлнэ.
Урвалж бэлтгэх
Урвалж I: 1 г сүүний казеиныг 50 мл 0.1 М натрийн фосфатын уусмалд (рН 8.0) уусгаж, 65-70 ℃ усанд 15 минутын турш өсгөвөрлөж, хутгаж, уусгаж, усаар хөргөж, натрийн гидроксидоор рН 8.0 хүртэл тохируулж, тогтооно. 100 мл.
Урвалж II: 0.1М трихлорацетик хүчил, 0.2М натрийн ацетат, 0.3М цууны хүчил.
Урвалж III: 0.4M Na2CO3шийдэл.
Урвалж IV: Forint урвалжийг 5 удаа цэвэр усаар шингэлнэ.
Урвалж V: фермент шингэрүүлэгч: 0.1М натрийн фосфатын уусмал (рН 8.0).
Урвалж VI: тирозин уусмал: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 умол/мл тирозин 0,2М HCL-д ууссан.
Процедур
1. 0.5мл урвалж I-г 37℃ хүртэл урьдчилан халааж, 0.5мл ферментийн уусмал нэмээд сайтар хольж, 37℃-т 10 минутын турш өсгөвөрлөнө.
2. Урвалыг зогсоохын тулд 1 мл урвалж II нэмээд сайтар хольж, 30 минутын турш инкубацийг үргэлжлүүлнэ.
3. Центрифуг хийх урвалын уусмал.
4. 0.5мл дээд давхаргыг авч, 2.5мл урвалж III, 0.5мл урвалж IV нэмээд сайтар хольж, 37℃-т 30 минутын турш өсгөвөрлөнө.
5. ОД660ОД гэж тодорхойлсон1;хоосон хяналтын бүлэг: 0.5мл урвалж V-ийг OD тодорхойлохын тулд ферментийн уусмалыг орлуулахад ашигладаг660ОД гэж2, ΔOD=OD1-ОД2.
6. L-тирозин стандарт муруй: 0.5 мл өөр концентрацитай L тирозин уусмал, 2.5 мл урвалж III, 5 мл центрифугийн хоолойд 0.5 мл урвалж IV, 37 ℃ температурт 30 минутын турш өсгөвөрлөж, OD илрүүлэх660L-тирозины өөр өөр концентрацийн хувьд Y=kX+b стандарт муруйг олж авсан бөгөөд Y нь L-тирозины концентраци, X нь OD юм.600.
Тооцоолол
2: Урвалын уусмалын нийт эзэлхүүн (мл)
0.5: Ферментийн уусмалын хэмжээ (мл)
0.5: Хромогенийг тодорхойлоход ашигласан шингэний урвалын хэмжээ (мл)
10: Урвалын хугацаа (мин)
Df: Олон дахин шингэлэх
C: Ферментийн концентраци (мг/мл)
Лавлагаа
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972); 23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Биофиз.Res.Коммун.(1971);44:513.
3. Хилз, Х.болон бусад.евро.J. Биохим.(1975);56:103–108.
4. Самбрук Жet бусад, Молекулын клонжуулалт: Лабораторийн гарын авлага, 2-р хэвлэл, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Зураг 2 Хамгийн оновчтой температур
20 мМ К-фосфатын буфер дэх урвал рН 8.0.Ферментийн концентраци: 1 мг/мл
Зураг 3 рН Тогтвортой байдал
25℃, 50мМ буфер уусмалаар 16 цаг эмчилгээ: рН 4.5-5.5, ацетат;рН 6.0-8.0, Na-фосфат;рН 8.0-9.0, Tris-HCL.рН 9.0-12.5, Глицин-NaOH.Ферментийн концентраци: 1 мг/мл
Зураг 4 Дулааны тогтвортой байдал
50 мм Tris-HCL буфер, рН 8.0 бүхий 30 минутын эмчилгээ.Ферментийн концентраци: 1 мг/мл
Зураг 5 Хадгалалт тогтвортойty at 25℃
