мРНХ Cap2'-O-Methyltransferase

mRNA Cap 2´ -O-methyltransferase нь вакцины mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase-ийн генийг агуулсан рекомбинант E. coli омогоос гаралтай.Энэ фермент нь РНХ-ийн 5'төгсгөлийн тагны бүтцэд зэргэлдээх эхний нуклеотидын 2´-O байрлалд метилийн бүлгийг нэмдэг. Фермент нь S-аденозилметиониныг (SAM) метилийн донор болгон битүүмжилсэн РНХ-ийг метилжуулахад ашигладаг. -0) үр дүнд нь cap- 1 бүтэц бий болно.

Cap1 бүтэц нь трансфекц болон бичил тарилгын туршилтанд мРНХ-ийн илэрхийлэлийг сайжруулж, орчуулгын үр ашгийг нэмэгдүүлж чадна. Энэ фермент нь субстрат болгон m7GpppN тагтай РНХ-г тусгайлан шаарддаг.Энэ нь 5´ төгсгөлд pN, ppN, pppN эсвэл GpppN бүхий РНХ-г ашиглаж чадахгүй.Бүрхүүлтэй РНХ-ийг аналог таг ашиглан in vitro транскрипцээр эсвэл Вакциниа таглах фермент ашиглан ферментийн таглаагаар бэлтгэж болно.

Бүрэлдэхүүн хэсгүүд

мРНХ таг 2´-О-Метилтрансфераза (50U/μL)

10×Capping Reaction Buffer

Хадгалах

Хадгалахад -25～- 15℃ （Хөлдөх гэсэлтийн давтагдахаас зайлсхий）

Хадгалах буфер

20 мМ Tris-HCl（рН 8.0，25℃), 100 мМ NaCl, 1 мм DTT, 0. 1 мм EDTA, 0. 1% Triton X- 100， 50% глицерол.

Нэгжийн тодорхойлолт

Нэг нэгжийг 37°С-т 1 цагийн дотор 80 нт хязгаартай РНХ транскриптийн 10 пмоле метилжүүлэхэд шаардагдах ферментийн хэмжээг тодорхойлно.

Чанарын хяналтын шинжилгээ

Экзонуклеаз:50U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase-тай 1μg λ-Hind III задаргаатай ДНХ-ийг 37 ℃ температурт 16 цагийн турш агароз гель электрофорезоор тодорхойлсноор задрал үүсэхгүй.

Эндонуклеаз: 50 U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase-тай 1 мкг λDNA-тай 37℃ температурт 16 цагийн турш агароз гель электрофорезээр тодорхойлсноор задрал үүсэхгүй.

Никас: 50U mRNA Cap 2´ -O-Methyltransferase-тай 1μg pBR322-тай 37 ℃ температурт 16 цагийн турш агароз гель электрофорезээр тодорхойлсноор задрал үүсэхгүй.

RNase: 50U mRNA Cap 2´ -O-Methyltransferase-тай 1.6μg MS2 RNA-тай 37℃ температурт 4 цагийн турш агароз гель электрофорезээр тодорхойлсноор задрал үүсэхгүй.

E. коли ДНХ: 50U мРНХ таг 2 ´ -О-Метилтрансфераза нь байгаа эсэхийг шалгадаг.E. коли тусгай праймер бүхий TaqMan qPCR ашиглан геномын ДНХE. коли 16S рРНХ байрлал.TheE. коли геномын ДНХ-ийн бохирдол =1E. коли геном.

Бактерийн Эндотоксин: LAL-тест, Хятадын фармакопейн IV 2020 оны хэвлэлд заасны дагуу гель хязгаарлах туршилтын арга, ерөнхий дүрэм (1143).Бактерийн эндотоксины агууламж =10 ЕС/мг байх ёстой.

Урвалын систем ба нөхцөл

1. 1.5 мл-ийн багтаамжтай микрофюжийн хуруу шилэнд 16.0 мкл эцсийн эзэлхүүнтэй болтол нь тагласан РНХ болон РНазгүй H2O-г зохих хэмжээгээр холбоно.

2. 65℃ температурт 5 минутын турш халааж, дараа нь 5 минутын турш мөстэй ванн хийнэ.

3. Дараах бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг заасан дарааллаар нэмнэ (Хязгаарлагдмал РНХ-ийн метилжилт

10-аас бага

*10× Хамгаалах урвалын буфер: 500 мм Tris-HCl(рН 8.0, 25℃), 50 мм KCl, 10 мм MgCl2 、 10 мм DTT.

4. 37℃ температурт 1 цагийн турш өсгөвөрлөнө (200 н-ээс бага зорилтот фрагментийг 2 цаг инкубацлахыг зөвлөж байна).

Хэрэглээ

Микро тарилга ба трансфекция туршилтын үед мРНХ-ийн илэрхийлэлийг сайжруулах.

Ашиглалтын талаархи тэмдэглэл

1. Урвалын өмнө РНХ-г цэвэршүүлж, нуклеазгүй усанд уусгах ба бүх уусмалд EDTA болон ион агуулаагүй байх ёстой.

2. Транскриптийн 5´ төгсгөлд хоёрдогч бүтцийг арилгахын тулд дээжийн РНХ-ийг урвал эхлэхээс 5 минутын өмнө 65℃ температурт халаахыг зөвлөж байна.Нарийн төвөгтэй 5 ´ терминалын бүтцийн хувьд үүнийг 10 минут хүртэл сунгаж болно.