Vaccinia вирусыг хязгаарлах фермент

Vaccinia вирусыг таглах фермент нь Vaccinia таглах ферментийн генийг агуулсан рекомбинант E. coli омогоос гаралтай.Энэхүү ганц фермент нь хоёр дэд нэгжээс (D1 ба D12) бүрдэх ба гурван ферментийн үйл ажиллагаатай (D1 дэд нэгжээр РНХ трифосфатаза ба гуанилилтрансфераза, D12 дэд нэгжээр гуанин метилтрансфераза) байдаг.Вакциниа вирусын таглах фермент нь РНХ-ийн 5′ төгсгөлд 7-метилгуанилат бүрхэвчний бүтцийг (m7Gppp, Cap 0) тусгайлан бэхлэх чадвартай бүрхэвч үүсэхийг хурдасгахад үр дүнтэй байдаг.Бүрхүүлийн бүтэц (Cap 0) эукариотуудад мРНХ-ийн тогтворжилт, тээвэрлэлт, орчуулгад чухал үүрэг гүйцэтгэдэг.РНХ-ийг ферментийн урвалаар хаах нь in vitro транскрипц, трансфекция, бичил тарилга хийх РНХ-ийн тогтвортой байдал, орчуулгыг мэдэгдэхүйц сайжруулдаг үр дүнтэй бөгөөд энгийн арга юм.

Бүрэлдэхүүн хэсгүүд

Вакциниа вирусыг хязгаарлах фермент (10 U/μL)

10×Capping Buffer

Хадгалах нөхцөл

Хадгалахад -25～- 15℃ （ Давтан хөлдөөх гэсгээхээс зайлсхий）

Хадгалах буфер

20 мМ Tris-HCl (рН 8.0), 100 мМ NaCl,

1мМ DTT, 0. 1мМ EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% глицерол.

Нэгжийн тодорхойлолт

Вакциниа вирусын таглах ферментийн нэг нэгж нь 37°С-т 1 цагийн дотор 10пмол GTP-ийг 80нт транскриптэд оруулахад шаардагдах ферментийн хэмжээгээр тодорхойлогддог.

Чанарын шалгалт

Экзонуклеаз:1μг λ-Hind III задаргаатай ДНХ-тай 10U Vaccinia вирусын таглах ферментийг 37 ℃ температурт 16 цагийн турш хэрэглэхэд агароз гель электрофорезээр тодорхойлогдсон задрал үүсэхгүй.

Эндонуклеаз:10U Vaccinia вирусын таглах ферментийг 1μg λDNA-тай 37℃ температурт 16 цагийн турш хэрэглэхэд агароз гель электрофорезоор тодорхойлогдохуйц задрал гарахгүй.

Никас:1 мкг pBR322 бүхий 10U Vaccinia вирусын таглах ферментийг 37 ℃ температурт 16 цагийн турш хэрэглэхэд агароз гель электрофорезээр тодорхойлогддог задрал үүсэхгүй.

RNase:1.6 мкг MS2 РНХ бүхий 10U Vaccinia вирусын таглах ферментийг 37℃ температурт 4 цагийн турш хэрэглэхэд агароз гель электрофорезээр тодорхойлогдохуйц задрал үүсэхгүй.

1.коли ДНХ:10U Vaccinia вирусын таглах ферментийг E. coli геномын ДНХ байгаа эсэхийг E. coli 16S rRNA локусын тусгай праймер бүхий TaqMan qPCR ашиглан шалгадаг.E. coli геномын ДНХ-ийн бохирдол нь ≤1 E. coli геном юм.

2.Бактерийн Эндотоксин: LAL-тест, Хятадын фармакопейн IV 2020 оны хэвлэлд заасны дагуу гель хязгаарлах туршилтын арга, ерөнхий дүрэм (1143).Бактерийн эндотоксины агууламж ≤10 ЕС/мг байх ёстой.

Урвалын систем ба нөхцөл

1. Хамгаалах протокол (урвалын хэмжээ: 20 мкл)

Энэ процедур нь 10μg РНХ-ийн (≥100 nt) хязгаарлах урвалд хамаарах бөгөөд туршилтын шаардлагын дагуу үүнийг нэмэгдүүлэх боломжтой.

I) 10 мкг РНХ ба нуклеазгүй H2O-г 1.5 мл-ийн микрофюгийн хоолойд 15.0 мкл эцсийн эзэлхүүнтэй болтол нэгтгэнэ.*10×Capping Buffer: 0.5M Tris-HCl, 50mM KCl, 10mM MgCl2, 10mM DTT, (25℃, pH 8.0)

2) 65 градусын температурт 5 минут халааж, дараа нь 5 минутын турш мөсөн ваннд хийнэ.

3) Дараах бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг заасан дарааллаар нэмнэ

*10×Capping Buffer: 0.5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH8.0)

4) 37°С-т 30 минутын турш өсгөвөрлөнө, одоо РНХ битүүмжлэгдсэн бөгөөд урсгалын доод хэсэгт хэрэглэхэд бэлэн боллоо.

2. 5′ терминал шошгоны урвал (урвалын хэмжээ: 20 мкл)

Энэхүү протокол нь 5´ трифосфат агуулсан РНХ-г шошголоход зориулагдсан бөгөөд хэрэгцээний дагуу томруулж болно.Шошгоны үр ашигт РНХ-ийн молийн харьцаа: GTP, түүнчлэн РНХ дээж дэх GTP агууламж нөлөөлнө.

1) Тохирох хэмжээний РНХ ба нуклеазгүй H2O-г 1.5 мл-ийн микрофюгийн хоолойд 14.0 мкл эцсийн эзэлхүүнтэй болтол холино.

2) 65 градусын температурт 5 минут халааж, дараа нь 5 минутын турш мөсөн ваннд хийнэ.

3) Дараах бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг заасан дарааллаар нэмнэ.

** GTP MIX нь GTP болон цөөн тооны тэмдэглэгээг хэлнэ.GTP-ийн концентрацийг үзнэ үүТайлбар 3 руу.

4) 37°С-т 30 минутын турш өсгөвөрлөнө, РНХ-ийн 5′ төгсгөл нь шошготой бөгөөд урсгалын доод хэсэгт бэлэн болсон байна.

Хэрэглээ

1. Орчуулгын шинжилгээ/in vitro орчуулгын өмнө мРНХ-г таглах

2. mRNA-ийн 5´ төгсгөлийг шошголох

Ашиглалтын талаархи тэмдэглэл

1.Вакциниа таглах ферментээр инкубацийн өмнө РНХ-ийн уусмалыг халаах нь хуулбарын 5-р төгсгөлийн хоёрдогч бүтцийг арилгадаг.Өндөр бүтэцтэй 5 төгсгөлтэй сийрүүлгийн хугацааг 60 минут хүртэл сунгана.

2. Урвалыг хязгаарлахад ашигладаг РНХ-г хэрэглэхийн өмнө цэвэршүүлж, нуклеазгүй усанд түдгэлзүүлсэн байх ёстой.EDTA байх ёсгүй бөгөөд уусмал нь давсгүй байх ёстой.

3. 5´ төгсгөлийг тэмдэглэхийн тулд GTP-ийн нийт концентраци нь урвал дахь мРНХ-ийн молийн концентрацаас 1-3 дахин их байх ёстой.

4. Бодит байдлын дагуу урвалын системийн эзлэхүүнийг томруулж эсвэл багасгаж болно.