PNGase F
Пептид-N-гликозидаза F (PNGase F) нь гликопротейноос бараг бүх N-холбогдсон олигосахаридуудыг зайлуулах хамгийн үр дүнтэй ферментийн арга юм.PNGase F нь N-холбогдсон гликопротеины өндөр манноз, эрлийз, нийлмэл олигосахаридын дотоод GlcNAc ба аспарагины үлдэгдлийг хооронд нь салгадаг амидаза юм.
Өргөдөл
Энэ фермент нь уурагаас нүүрс усны үлдэгдлийг зайлуулахад тустай.
Бэлтгэл ба тодорхойлолт
| Гадаад төрх | Өнгөгүй шингэн |
| Уургийн цэвэр байдал | ≥95% (SDS-PAGE-с) |
| Үйл ажиллагаа | ≥500,000 U/мл |
| Экогликозидаза | Ямар ч үйл ажиллагаа илрүүлсэнгүй (ND) |
| Эндогликозидаза F1 | ND |
| Эндогликозидаза F2 | ND |
| Эндогликозидаза F3 | ND |
| Эндогликозидаз H | ND |
| Протеаз | ND |
Үл хөдлөх хөрөнгө
| EC дугаар | 3.5.1.52(Бичил биетний рекомбинант) |
| Молекулын жин | 35 кДа (SDS-PAGE) |
| Изоэлектрик цэг | 8. 14 |
| Хамгийн оновчтой рН | 7.0-8.0 |
| Хамгийн оновчтой температур | 65 ° C |
| Субстратын өвөрмөц байдал | GlcNAc ба аспарагины үлдэгдэл хоорондын гликозидын холбоог таслах Зураг 1 |
| Таних сайтууд | α1-3 фукоз агуулаагүй бол N-холбогдсон гликанууд Зураг 2 |
| Идэвхжүүлэгчид | ДТТ |
| Дарангуйлагч | SDS |
| Агуулахын температур | -25 ~-15 ℃ |
| Дулаан идэвхгүйжүүлэх | 1μL PNGase F агуулсан 20μL урвалын хольцыг 75 °C-т 10 минутын турш инкубацийн аргаар идэвхгүйжүүлнэ. |
Зураг 1 PNGase F-ийн субстратын өвөрмөц байдал
Зураг 2 PNGase F-ийн таних байрлал.
Дотоод GlcNAc үлдэгдэл нь α1-3 фукозтой холбогдсон үед PNGase F нь N-холбогдсон олигосахаридуудыг гликопротеиноос салгаж чадахгүй.Энэ өөрчлөлт нь ургамал болон зарим шавьжны гликопротейнд түгээмэл байдаг.
Cөрсөлдөгчид
|
| Бүрэлдэхүүн хэсгүүд | Төвлөрөл |
| 1 | PNGase F | 50 мкл |
| 2 | 10 × Гликопротеины денатурат буфер | 1000 мкл |
| 3 | 10 × Гликобуфер 2 | 1000 мкл |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 мкл |
Нэгжийн тодорхойлолт
Нэг нэгж(U) нь нийт 10 мкл урвалын эзэлхүүнтэй 37°С-т 10 мкг денатуржуулсан RNase B-ээс 1 цагийн дотор нүүрс усны 95% -ийг арилгахад шаардагдах ферментийн хэмжээг хэлнэ.
Урвалын нөхцөл
1. 1-20 мкг гликопротейнийг ионгүйжүүлсэн усаар уусгаж, 1 мкл 10 × гликопротейн денатуринг буфер ба H2O (шаардлагатай бол) нэмээд 10 мкл нийт урвалын эзэлхүүнтэй болгоно.
2.1000С-т 10 минутын турш өсгөвөрлөж, мөсөн дээр хөргөнө.
3.2 мкл 10×GlycoBuffer 2, 2 мкл 10% NP-40 нэмээд холино.
4.1-2 мкл PNGase F ба H нэмнэ2O (шаардлагатай бол) 20 мкл нийт урвалын эзэлхүүнийг хийж, холино.
5.Урвалыг 37°С-т 60 минутын турш өсгөвөрлөнө.
6.SDS-PAGE шинжилгээ эсвэл HPLC шинжилгээнд зориулагдсан.
