5×Neoscript Fast RT-qPCR Premix plus-UNG
Муур дугаар: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) нь нэг үе шаттай урвуу транскрипц болон тоон ПГУ (qRT-PCR) хийхэд тохиромжтой, маш тогтвортой нэг хоолойт датчик дээр суурилсан холимог юм.Энэ нь праймер болон датчикийг урьдчилан холихыг дэмждэг бөгөөд бага температурт удаан хадгалсны дараа тогтвортой байдаг.Шинжилгээнд хамрагдах дээжийг хоолойг нээх/соруулах ажиллагаагүйгээр ашиглах үед шууд нэмж болно.Энэ бүтээгдэхүүн нь халуун эхлэх ДНХ полимераз, M-MLV, халуунд тэсвэртэй урацил ДНХ гликозилаз (TS-UNG), RNase дарангуйлагч, MgCl зэрэг бүрэлдэхүүн хэсгүүдээр хангадаг.2, dNTPs (dTTP-ийн оронд dUTP-тэй), тогтворжуулагч.Урвуу транскриптаза ба ДНХ полимеразын генийн өөрчлөлттэй хурдан олшруулалтын тусламжтайгаар ПГУ-ын олшруулалтыг 20-40 минутын дотор дуусгах боломжтой.Энэхүү урвалж нь дарангуйлах эсрэг олшруулах фермент болон UNG ферментийн холимог фермент бүхий qPCR-д зориулсан тусгай буфер ашигладаг.Тиймээс зорилтот генийг сайн олшруулж, ПГУ-ын үлдэгдэл болон аэрозолийн бохирдлоос үүдэлтэй хуурамч олшрохоос сэргийлж чадна.Энэхүү урвалж нь Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad, Roche зэрэг үйлдвэрлэгчдийн флюресцент тоон ПГУ-ын ихэнх багажтай нийцдэг.
Бүрэлдэхүүн хэсэг
1.25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix
2.5×Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP)
Хадгалах нөхцөл
Бүх бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг удаан хугацаагаар хадгалахын тулд -20 хэмд, 3 сар хүртэл 4 хэмд хадгална.Гэсгээсний дараа сайтар хольж, хэрэглэхийн өмнө центрифуг хийнэ.Байнга хөлдөөх гэсгээхээс зайлсхий.
qRT-ПГУ-ын урвалын системийг бэлтгэх
| Бүрэлдэхүүн хэсгүүд | 25мкЛСистем | 50мкЛСистем | Эцсийн концентраци |
| 5×Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP) | 5 мкл | 10 мкл | 1× |
| 25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix | 1 мкл | 2 мкл | 1× |
| 25×Праймер-датчик хольцa | 1 мкл | 2 мкл | 1× |
| Загвар РНХb | – | – | – |
| ddH2O | 25 мкл хүртэл | 50 мкл хүртэл | – |
1) a. Праймерын эцсийн концентраци нь ихэвчлэн 0.2μM байна.Илүү сайн үр дүнд хүрэхийн тулд праймерын концентрацийг 0.2-1μM-ийн хүрээнд оновчтой болгож болно.Ерөнхийдөө датчикийн концентрацийг 0.1-0.3μM-ийн хүрээнд оновчтой болгож болно.
2) b. Хурдан ПГУ-ын процедурыг ашиглах үед праймер болон датчикийн концентрацийг нэмэгдүүлэх нь олшруулалтын үр дүнд илүү сайн үр дүнд хүргэж болзошгүй тул тэдгээрийн харьцааг зохих ёсоор нь оновчтой болгох хэрэгтэй.
3) Төрөл бүрийн сорьцууд нь дарангуйлагчийн төрөл, агуулга, зорилтот генийн хуулбарын тоог агуулдаг.Дээжийн хэмжээг бодит нөхцөлөөр авч үзэх хэрэгтэй.Шаардлагатай бол дээжийг нуклеазгүй ус эсвэл TE буферээр шингэлнэ.
Урвал Cнөхцөл
| ПГУ-ын тогтмол процедур | ПГУ-ын хурдан процедур | ||||||
| Процедур | Температур. | Цаг хугацаа | Цикл | Процедур | Температур. | Цаг хугацаа | Цикл |
| Урвуу транскрипци | 50℃ | 10-20 минут | 1 | Урвуу транскрипци | 50℃ | 5мин | 1 |
| Полимераз Идэвхжүүлэх | 95℃ | 1-5 минут | 1 | Полимераз Идэвхжүүлэх | 95℃ | 30-аад он | 1 |
| Денатураци | 95℃ | 10-20 секунд | 40-50 | Денатураци | 95℃ | 1-3 секунд | 40-50 |
| Хатаах болон Өргөтгөл | 56-64 хэм байна | 20-60-аад он | Хатаах болон Өргөтгөл | 56-64 хэм байна | 3-20с | ||
Чанарын шалгалт
1.Функцийг илрүүлэх: qPCR-ийн мэдрэмж, өвөрмөц байдал, давтагдах чадвар.
2.Экзоген нуклеазын идэвхжил байхгүй: экзоген эндонуклеаз ба экзонуклеазын бохирдол байхгүй.
Тэмдэглэл
1.Түргэн ДНХ полимеразын олшруулах хурд нь 1 кб/10 секундээс багагүй байна.Төрөл бүрийн ПГУ-ын хэрэгсэл нь халаах, хөргөх хурд, температурын хяналтын горим, дулаан дамжуулалттай байдаг тул праймер/датчикийн концентраци болон ажиллах аргыг тусгай хурдан ПГУ-ын хэрэгсэлтэй хослуулан оновчтой болгох нь чухал юм.
2.Энэхүү бүтээгдэхүүн нь өргөн хэрэглээний чадвартай бөгөөд өндөр мэдрэмжтэй молекулын оношлогоонд тохиромжтой.Гурван шатлалт ПГУ-ын аргыг бага температуртай праймеруудад эсвэл 200 bp-ээс дээш урт фрагментийг өсгөхөд зөвлөж байна.
3.Янз бүрийн ампликонууд dUTP-ийн ашиглалтын үр ашиг, UNG-д өөр өөр мэдрэмжтэй байдаг тул UNG системийг ашиглах үед илрүүлэх мэдрэмж буурч байвал урвалжуудыг оновчтой болгох хэрэгтэй.Шаардлагатай бол техникийн дэмжлэг авахын тулд бидэнтэй холбоо барина уу.
4.Дамжуулсан ПГУ-ын бүтээгдэхүүнийг олшруулахаас зайлсхийхийн тулд олшруулахын тулд тусгай туршилтын талбай болон пипетк шаардлагатай.Бээлийтэй хагалгаа хийж, ойр ойрхон сольж, олшруулсны дараа ПГУ-ын хоолойг нээж болохгүй.
