EndoFree Plasmid Maxi иж бүрдэл

Хадгалах нөхцөл

RNaseA-г -30 ~ -15 ℃ хэмд хадгалж, ≤ 0 ℃ температурт тээвэрлэнэ.

Эндотоксин цэвэрлэгчийг 2 ~ 8 хэмд нэг сарын турш, -30 ~ -15 хэмд удаан хугацаагаар хадгалах боломжтой.≤0℃ температурт тээвэрлэнэ.

Бусад бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг тасалгааны температурт (15 ~ 25 ℃) хадгалж, тасалгааны температурт тээвэрлэнэ.

Бүрэлдэхүүн хэсгүүд

RNaseA:10 мг/мл, РНХ-г арилгахад хэрэглэнэ.

P1 буфер:бактерийн суспензийн буфер, хэрэглэхийн өмнө RNaseA-г P1 буферт нэмнэ.

P2 буфер:бактерийн задралын буфер (SDS/NaOH агуулсан).

P4 буфер:саармагжуулах буфер.

Эндотоксин устгагч:плазмидын түүхий ханднаас эндотоксиныг үр дүнтэй арилгана.

Буфер PW:угаах буфер, эхний хэрэглэхийн өмнө этанолын тогтоосон хэмжээг нэмнэ.

Сүрьеэгийн буфер:элюцийн буфер.

FastPure ДНХ Макси багана:плазмидын ДНХ шингээх багана.

Цуглуулгын хоолой 50 мл:шүүсэн ус цуглуулах хоолой.

Эндотоксингүй цуглуулах хоолой:плазмидын ДНХ цуглуулах хоолой.

Бэлтгэсэн материал

Үнэмлэхүй этанол, изопропанол, 50 мл дугуй ёроолтой центрифугийн хоолой, 50 мл эндотоксин агуулаагүйцентрифугийн хоолой.

Хэрэглээ

Энэхүү бүтээгдэхүүн нь 150-300 мл бактерийн уусмалаас плазмидыг их хэмжээгээр гаргаж авахад тохиромжтой.нэг шөнийн дотор өсгөвөрлөнө.

Туршилтын үйл явц

1. Өсгөвөрлөсөн 150-200 мл (300 мл-ээс ихгүй) бактерийн уусмалыг нэг шөнийн дотор авч центрифуг хийнэ.1-2 минутын турш ойролцоогоор 11,000 эрг / мин (12,000 × г).Супернатантыг хаяж, бактерийг цуглуул.

Δ 50 мл-ээс дээш бактерийн уусмал цуглуулах үед бактерийн уусмал нэмж, центрифуг хийх, хэт шингэнийг хаях болон ижил 50 мл-ийн хуруу шилэнд бусад алхмуудыг хийх замаар бактерийг цуглуулж болно.

олон удаа.

2. Центрифугт 7.5 мл буфер P1 нэмнэ (RNaseA буфер P1-д нэмсэн эсэхийг шалгана уу)нян агуулсан хуруу шилийг эргүүлж, соруураар сайтар холино.

Δ Энэ үе шатанд бактерийг бүрэн дахин түдгэлзүүлэх нь гарцад чухал ач холбогдолтой бөгөөд дахин түдгэлзүүлсний дараа бактерийн бөөгнөрөл байх ёсгүй.Хэрэв сайтар холигдоогүй бактерийн бөөгнөрөл байгаа бол энэ нь задралд нөлөөлж, ургац багатай, цэвэршилттэй болно.Хэрэв бактерийн уусмалын OD600 нь 0.65 бол 150 мл бактерийн уусмалаас гаргаж авахдаа 7.5 мл буфер P1 хэрэглэхийг зөвлөж байна;OD600 нь 0.75 бол 8 мл буфер P1 хэрэглэж, P2 ба P4 буферийн эзэлхүүнийг зохих ёсоор өөрчлөх шаардлагатай.Хэрэв бактерийн уусмалын хэмжээ 200 мл хүртэл нэмэгдвэлP1, P2, P4 буферийн эзлэхүүнийг пропорциональ хэмжээгээр нэмэгдүүлнэ.

3. 2-р алхамаас бактерийн суспензэнд 7.5 мл буфер P2 нэмээд 6-8 удаа дээш доош зөөлөн холино.удаа, тасалгааны температурт 4-5 минутын турш өсгөвөрлөнө.

Δ Зөөлөн эргүүлж сайтар холино.Хуйвалдалт нь геномын ДНХ-ийн хуваагдлыг үүсгэж, олборлосон плазмид геномын ДНХ-ийн хэлтэрхий үүсэх болно.Энэ үед уусмал нь наалдамхай, тунгалаг болж, бактери бүрэн задарсан болохыг харуулж байна.Плазмидуудыг устгахаас зайлсхийхийн тулд үргэлжлэх хугацаа 5 минутаас хэтрэхгүй байх ёстой.Хэрэв уусмал нь тунгалаг биш бол хэт олон бактери үүсч болзошгүйбүрэн бус задралтай тул нянгийн хэмжээг зохих ёсоор бууруулах хэрэгтэй.

4. 3-р алхамаас бактерийн суспензэнд 7.5 мл P4 буфер нэмж, уусмалыг P2 буферийг бүрэн саармагжуулахын тулд нэн даруй 6-8 удаа зөөлөн эргүүлнэ.Энэ үед цагаан флокулент тунадас гарч ирэх ёстой.Ойролцоогоор 11,000 эрг/мин (12,000 × г)-аас дээш 10-15 минутын турш центрифуг хийж, дээд давхаргыг 50 мл-ийн дугуй ёроолтой центрифугийн шинэ хоолойд (өөрөө бэлтгэсэн) болгоомжтой пипеткээр хийж,хөвөгч цагаан тунадасыг соруулж авна.

Δ P4 буфер нэмээд сайтар холихын тулд нэн даруй эргүүлнэ.Саармагжилтад нөлөөлж болохуйц орон нутгийн хур тунадас үүсэхээс сэргийлэхийн тулд цагаан тунадас уусмалд жигд тархах хүртэл хоолойг байлгана.Центрифуг хийхээс өмнө жигд цагаан флокулент тунадас байхгүй бөгөөд центрифуг хийсний дараа хэт шингэн тунгалаг биш бол хоолойгдахин 5 минутын турш центрифуг хийнэ.

5. 4-р үе шатаас эхлэн шингэний шингэнд 0.1 дахин их хэмжээгээр (устдаг шингэний 10%, ойролцоогоор 2,2 мл) эндотоксин цэвэрлэгчийг нэмээд эргүүлж холино.Уусмалыг мөсөн ваннд хийж эсвэл буталсан мөсөнд (эсвэл хөргөгчний хөлдөөгчид) уусмал нь булингараас тунгалаг, тунгалаг (эсвэл хэвээр) болтол 5 минутын турш хийнэ.бага зэрэг булингартай), хааяа хэд хэдэн удаа холино.

Δ Эндотоксин цэвэрлэгчийг дээд давхаргад нэмсний дараа дээд давхарга булингар болох боловчМөсөн ваннд хөргөсний дараа шингэний шингэн тунгалаг (эсвэл бага зэрэг булингартай) болно.

6. Дээд давхаргыг тасалгааны температурт (>25℃) 10-15 минут байлгасны дараа булингар болно.түүний температур өрөөний температур хүртэл нэмэгддэг.Дараа нь супернатантыг эргүүлж холих хэрэгтэй.

Δ Хэрэв өрөөний температур бага байвал эсвэл олборлох хугацааг багасгахыг хүсвэл хэт шингэнийг 37 ~ 42 ℃ усан ваннд 5-10 минутын турш өсгөвөрлөх ба дараагийн алхмыг дээд давхаргын дараа хийж болно.булингартай болдог.

7. Фазыг салгахын тулд тасалгааны температурт (температур нь >25℃ байх ёстой) 10 минутын турш 11,000 эрг / мин (12,000 × г) хурдаар центрифуг хийнэ.Дээд усан фаз нь ДНХ агуулдаг бол доод хөх тослог фазын давхарга нь эндотоксин болон бусад хольцыг агуулдаг.шилжүүлэхШинэ хоолой руу ДНХ агуулсан усан фаз батослог давхаргыг хая.

Δ Центрифуг хийх үед температур нь 25 хэмээс дээш байх ёстой, учир нь фазын үр дүнтэй тусгаарлалт байхгүй болнотемператур хэт бага байвал үүснэ.

Δ Хэрэв фазын тусгаарлалт үр дүнгүй бол центрифугийн температурыг 30℃ хүртэл тохируулж болно.Центрифуг хийх хугацааг 15 минут хүртэл нэмэгдүүлэх боломжтой.

Δ Цэнхэр тослог давхарга нь эндотоксин болон бусад хольц агуулсан тул сорж болохгүй.

Механизм

Дахин түдгэлзүүлэх Lysis саармагжуулах

◇ 7.5 мл буфер P1 нэмнэ

◇ 7.5 мл буфер P2 нэмнэ

◇ 7.5 мл буфер P4 нэмнэ

Эндотоксиныг зайлуулах

◇Эндотоксин цэвэрлэгчийг 0. 1 дахин их хэмжээгээр нэмнэ

Холбох, угаах

◇ Изопропанолыг 0.5 дахин их хэмжээгээр нэмнэ

◇ 10 мл буфер PW нэмнэ