M-MLV Neoscript урвуу транскриптаза
Neoscript урвуу транскриптаза нь Moloney хулганы лейкемийн вирүсийн гарал үүслийн M-MLV генийн мутацийн скрининг ба E.coli-д илэрхийлэгдэх урвуу транскриптаза юм.Фермент нь RNase H-ийн идэвхийг арилгадаг, өндөр температурт тэсвэртэй, өндөр температурт урвуу транскрипцид тохиромжтой.Иймд РНХ-ийн өндөр түвшний бүтэц, өвөрмөц бус хүчин зүйлсийн сДНХ-ийн нийлэгжилтэд үзүүлэх сөрөг нөлөөллийг арилгахад тустай бөгөөд өндөр тогтвортой байдал, урвуу транскрипцийн синтезийн чадвартай.Фермент нь илүү тогтвортой, урвуу транскрипцийн синтез хийх чадвартай.
Бүрэлдэхүүн хэсгүүд
1.200 U/μL Neoscript урвуу транскриптаза
2.5 × Эхний хэлхээний буфер (заавал биш)
* 5 × First-Strand Buffer нь dNTP агуулаагүй тул урвалын системийг бэлтгэхдээ dNTP нэмнэ үү.
Санал болгож буй програм
1.Нэг үе шаттай qRT-ПГУ.
2.РНХ вирус илрүүлэх.
Хадгалах нөхцөл
-20°С-д удаан хугацаагаар хадгалах, хэрэглэхийн өмнө сайтар хольж, хөлдөөх, гэсгээхээс зайлсхийх хэрэгтэй.
Нэгжийн тодорхойлолт
Нэг нэгж нь poly(A)•oligo(dT) ашиглан 37°С-т 10 минутын дотор 1 нмоль dTTP-ийг агуулна.25загвар/праймер болгон.
Чанарын шалгалт
1.SDS-PAGE электрофоретик цэвэршилт 98%-иас дээш.
2.Олшруулах мэдрэмж, багцаас багцын хяналт, тогтвортой байдал.
3.Экзоген нуклеазын идэвхжил байхгүй, экзоген эндонуклеаз эсвэл экзонуклеазын бохирдол байхгүй
Эхний гинжин урвалын уусмалын урвалын тохиргоо
1.Урвалын хольц бэлтгэх
| Бүрэлдэхүүн хэсгүүд | Эзлэхүүн |
| Олиго(дТ)12-18 Праймер эсвэл Random Primerа Эсвэл генийн тусгай праймеруудb | 50 цаг |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 цаг | |
| 10 мМ dNTP | 1 мкл |
| Загвар РНХ | Нийт РНХ≤ 5мкг;мРНХ≤ 1 мкг |
| RNase агуулаагүй dH2O | 10 мкл хүртэл |
Тэмдэглэл:a/b: Туршилтын хэрэгцээнд нийцүүлэн өөр төрлийн праймерыг сонгоно уу.
2.65 градусын температурт 5 минут халааж, мөсөн дээр 2 минутын турш хурдан хөргөнө.
3.Дээрх системд дараах бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг нийт 20 мкл эзэлхүүнтэй болгож, зөөлөн холино.
| Бүрэлдэхүүн хэсгүүд | Эзлэхүүн (мкЛ) |
| 5 × Эхний хэлхээний буфер | 4 |
| Neoscript урвуу транскриптаза (200 U/μL) | 1 |
| RNase дарангуйлагч (40 U/μL) | 1 |
| RNase агуулаагүй dH2O | 20 мкл хүртэл |
4. Дараах нөхцлийн дагуу урвалыг гүйцэтгэнэ үү.
(1) Санамсаргүй праймер хэрэглэж байгаа бол урвалыг 25 ℃ температурт 10 минут, дараа нь 50 ℃ температурт 30 ~ 60 минутын турш явуулна;
(2) Хэрэв Oligo dT эсвэл тусгай праймер хэрэглэж байгаа бол урвалыг 50 хэмд 30-60 минутын турш явуулна.
5.Neoscript урвуу транскриптазыг идэвхгүй болгохын тулд 95 хэмд 5 минутын турш халааж, урвалыг зогсооно.
6.Урвуу транскрипцийн бүтээгдэхүүнийг ПГУ-ын урвал болон флюресценцийн тоон ПГУ-ын урвалд шууд ашиглах, эсвэл -20℃ хэмд удаан хугацаагаар хадгалах боломжтой.
ПГУ Рүйлдэл:
1.Урвалын хольц бэлтгэх
| Бүрэлдэхүүн хэсгүүд | Төвлөрөл |
| 10 × ПГУ-ын буфер (dNTP агуулаагүй, Mg²+ үнэгүй) | 1× |
| dNTPs (dNTP тус бүр 10мМ) | 200 мкм |
| 25 мМ MgCl2 | 1-4 мм |
| Так ДНХ Полимераз (5U/μл) | 2-2.5 U |
| Праймер 1 (10 мкм) | 0.2-1 мкм |
| Праймер 2 (10 мкм) | 0.2-1 мкм |
| Загвара | ≤10% Эхний гинжин урвалын уусмал (2 мкл) |
| ddH2O | 50 мкл хүртэл |
Тэмдэглэл:a: Хэрэв эхний гинжин урвалын уусмалыг хэт их нэмбэл ПГУ-ын урвалыг саатуулж болно.
2.ПГУ-ын урвалын журам
| Алхам | Температур | Цаг хугацаа | Цикл |
| Урьдчилан денатураци | 95℃ | 2-5 минут | 1 |
| Денатураци | 95℃ | 10-20 сек | 30-40 |
| Хатаах | 50-60 ℃ | 10-30 сек | |
| Өргөтгөл | 72℃ | 10-60 сек |
Тэмдэглэл
1.42 ℃ ~ 55 ℃ хооронд урвуу транскрипцийн температурыг оновчтой болгоход тохиромжтой.
2.Энэ нь илүү тогтвортой, өндөр температурт урвуу транскрипцийг өсгөхөд тохиромжтой.Нэмж дурдахад энэ нь РНХ-ийн бүтцийн нарийн төвөгтэй хэсгүүдийг үр дүнтэйгээр нэвтрүүлэхэд таатай байдаг.Бас, тэрнь нэг шатлалт мультиплекс флюресценцийн тоон RT-PCR илрүүлэхэд тохиромжтой.
3.Төрөл бүрийн ПГУ-ын олшруулах ферментүүдтэй сайн нийцдэг бөгөөд өндөр мэдрэмжтэй RT-PCR урвалуудад тохиромжтой.
4.Өндөр мэдрэмжтэй нэг шатлалт флюресценцийн тоон RT-PCR урвалд тохиромжтой, загваруудын бага концентрацийг илрүүлэх хурдыг үр дүнтэй сайжруулдаг.
5.cDNA номын сан байгуулахад тохиромжтой.
