Rnase дарангуйлагч
Хулганы RNase дарангуйлагч нь E.coli-ээс ялгаруулж, цэвэршүүлсэн рекомбинант хулганы RNase дарангуйлагч юм.Энэ нь ковалент бус холбоогоор 1:1 харьцаатай RNase A, B эсвэл C-тэй холбогддог бөгөөд ингэснээр гурван ферментийн идэвхийг саатуулж, РНХ-ийг задралаас хамгаалдаг.Гэсэн хэдий ч энэ нь RNase 1, RNase T1, S1 Nuclease, RNase H эсвэл Aspergillus-ийн RNase-ийн эсрэг үр дүнтэй биш юм.Хулганы RNase дарангуйлагчийг RT-PCR, RT-qPCR болон IVT мРНХ-ээр туршсан бөгөөд төрөл бүрийн арилжааны урвуу транскриптаза, ДНХ полимераза, РНХ полимеразуудтай нийцэж байсан.
Хүний RNase дарангуйлагчтай харьцуулахад хулганы RNase дарангуйлагч нь исэлдэлтэнд маш мэдрэмтгий хоёр цистеин агуулаагүй бөгөөд энэ нь дарангуйлагчийг идэвхгүй болгоход хүргэдэг.Энэ нь DTT-ийн бага концентрацид (1 мм-ээс бага) тогтвортой байдаг.Энэ онцлог нь DTT-ийн өндөр концентраци нь урвалд сөрөг нөлөө үзүүлэх урвалд хэрэглэхэд тохиромжтой (жишээ нь, бодит цагийн RT-PCR).
Aхэрэглээ
Энэхүү бүтээгдэхүүнийг РНХ-ийн задралаас зайлсхийхийн тулд RNase хөндлөнгийн оролцоотой аливаа туршилтанд өргөнөөр ашиглаж болно, тухайлбал:
1.cDNA-ийн эхний хэлхээний нийлэгжилт, RT-PCR, RT-qPCR гэх мэт.
2.In vitro транскрипц/орчуулгын явцад РНХ-г задрахаас хамгаална (жишээ нь, in vitro вирусын хуулбарлах систем).
3.РНХ-ийг салгах, цэвэршүүлэх явцад RNase-ийн үйл ажиллагааг дарангуйлах.
Хадгалах нөхцөл
Бүтээгдэхүүнийг -25～-15 ℃ хэмд 2 жил хадгалах боломжтой.
Хадгалах буфер
50 мм KCl, 20 мм HEPES-KOH (рН 7.6, 25 ℃), 8 мм DTT ба 50% глицерин.
Нэгжийн тодорхойлолт
5 нг рибонуклеаза А-ийн идэвхийг 50%-иар дарангуйлахад шаардагдах хулганы RNase дарангуйлагчийн хэмжээг нэг нэгж (U) гэж тодорхойлсон.
Уургийн молекул жин
Хулганы RNase дарангуйлагчийн молекул жин нь 50 кДа байна.
Чанарын шалгалт
Экзонуклеаз Үйл ажиллагаа:
1 мкг λ -Hind III задаргаатай ДНХ-ийн 40 U хулганын RNase дарангуйлагчийг 37 ℃ температурт 16 цагийн турш агароз гель электрофорезоор тодорхойлсноор задрал үүсэхгүй.
Эндонуклеазын үйл ажиллагаа:
40 U хулганы RNase дарангуйлагчийг 1μг λ ДНХ-тай 37℃ температурт 16 цагийн турш хэрэглэхэд агароз гель электрофорезээр тодорхойлогдохуйц задрал гарахгүй.
Никлэх Үйл ажиллагаа:
40U хулганы RNase дарангуйлагчийг 1μг pBR322-тай 37℃ температурт 16 цагийн турш хэрэглэхэд агароз гель электрофорезээр тодорхойлогдохуйц задрал гарахгүй.
RNase Үйл ажиллагаа:
1.6μг MS2 РНХ-тай 40U хулганы RNase дарангуйлагчийг 37℃ температурт 4 цагийн турш хэрэглэхэд агароз гель электрофорезээр тодорхойлогдоход ямар ч задрал гарахгүй.
E.коли ДНХ:
40 U хулганы RNase дарангуйлагчийг E. coli геномын ДНХ байгаа эсэхийг E. coli 16S rRNA локусын өвөрмөц праймер бүхий TaqMan qPCR ашиглан шалгана.E. coli геномын ДНХ-ийн бохирдол ≤ 0.1 pg/40 U байна.
Notes
1. Хүчтэй хэлбэлзэл эсвэл хутгах нь ферментийг идэвхгүй болгоход хүргэдэг.
2. Энэ дарангуйлагчийн хамгийн оновчтой температурын хүрээ нь 25-55 ℃ байсан ба 65 ℃ ба түүнээс дээш температурт идэвхгүй болсон.
3. RNase H, RNase 1, RNase T1-ийн үйл ажиллагааг хулганы RNase дарангуйлагч дарангуйлаагүй.
4.РНазын идэвхжилийг дарангуйлах нь өргөн хүрээний рН-д (рН 5-9 бүгд идэвхтэй) илэрсэн бөгөөд хамгийн өндөр идэвхжил нь рН 7-8-д ажиглагдсан.
5. Рибонуклеазууд нь ихэвчлэн денатурацийн нөхцөлд үйл ажиллагаагаа хадгалж байдаг тул рибонуклеазтай нийлсэн RNase дарангуйлагч молекулуудыг денатуратлахаас зайлсхийх хэрэгтэй.Идэвхтэй рибонуклеазыг ялгаруулахаас сэргийлэхийн тулд 50 ° C-аас дээш температур, мочевин эсвэл бусад денатурат бодисуудын өндөр агууламжаас зайлсхийх хэрэгтэй.
