Proteinase K NGS (нунтаг)
Муур дугаар: HC4507A
NGS Protease K нь ферментийн өндөр идэвхжил, өргөн субстратын өвөрмөц чанар бүхий тогтвортой серин протеаз юм. Фермент нь гидрофобик амин хүчлүүд, хүхэр агуулсан амин хүчлүүд болон үнэрт амин хүчлүүдийн С-терминалтай зэргэлдээх эфирийн холбоо болон пептидийн холбоог илүү сайн задалдаг.Тиймээс уурагуудыг богино пептид болгон задлахад ихэвчлэн ашигладаг.NGS Protease K нь Asp агуулсан ердийн серин протеаз юм39- Түүний69-Сэр224Каталитик гурвал нь серин протеазуудад өвөрмөц бөгөөд каталитик төв нь Ca чиргүүлээр хүрээлэгдсэн байдаг.2+илүү өргөн хүрээний нөхцөлд ферментийн өндөр идэвхийг хадгалах, тогтворжуулах зориулалттай холбох газрууд.
Тодорхойлолт
| Гадаад төрх | Цагаан, цагаан өнгөтэй аморф нунтаг, лиофилижсэн |
| Тодорхой үйл ажиллагаа | ≥40U/мг хатуу |
| ДНаз | Аль нь ч илрээгүй |
| RNase | Аль нь ч илрээгүй |
| Биологийн ачаалал | ≤50CFU/г хатуу |
| Нуклейн хүчлийн үлдэгдэл | <5пг/мг хатуу |
Үл хөдлөх хөрөнгө
| Эх сурвалж | Tritirachium цомог |
| EC дугаар | 3.4.21.64(Tritirachium цомгийн рекомбинант) |
| Молекулын жин | 29кДа (SDS-PAGE) |
| Изоэлектрик цэг | 7.81 Зураг 1 |
| Хамгийн оновчтой рН | 7.0-12.0 (Бүгд өндөр үйл ажиллагаа явуулдаг) Зураг 2 |
| Хамгийн оновчтой температур | 65℃ Зураг 3 |
| рН-ийн тогтвортой байдал | рН 4.5-12.5 (25℃,16 цаг) Зураг 4 |
| Дулааны тогтвортой байдал | 50℃-аас доош (рН 8.0, 30мин) Зураг 5 |
| Хадгалалтын тогтвортой байдал | 25℃ хэмд 12 сар хадгална. Зураг 6 |
| Идэвхжүүлэгчид | SDS, мочевин |
| Дарангуйлагчид | Диизопропил фторфосфат;бензилсульфонил фтор |
Хадгалах нөхцөл
Лиофильжүүлсэн нунтаг -25~-15 ℃ температурт гэрлээс хол удаан хадгална;Ууссаны дараа тохирох эзэлхүүнтэй хэсэг болгон хуваагаад гэрлээс 2-8 хэмд богино хугацаанд, гэрлээс -25~15 хэмд удаан хугацаагаар хадгалах боломжтой.
Урьдчилан сэргийлэх
Ашиглах, жинлэх үед хамгаалалтын бээлий, нүдний шил зүүж, хэрэглэсний дараа агааржуулалт сайтай байлгана.Энэ бүтээгдэхүүн нь арьсны харшлын урвал, нүдийг цочрооход хүргэдэг.Хэрэв амьсгалсан бол харшил, астма, амьсгал давчдах шинж тэмдэг илэрч болно.Амьсгалын замын цочрол үүсгэж болзошгүй.
Нэгжийн тодорхойлолт
NGS Protease K-ийн нэг нэгжийг стандарт тодорхойлох нөхцөлд казеиныг 1 мкмоль L-тирозин болгон гидролиздэхэд шаардагдах ферментийн хэмжээг тодорхойлно.
Урвалж бэлтгэх
| Урвалж | Үйлдвэрлэгч | Каталог |
| Казеин техникийнүхрийн сүүнээс | Сигма Олдрих | C7078 |
| NaOH | Синопарм химийн бодисReagent Co., Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4· 2H2O | Синопарм химийн бодисReagent Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Синопарм химийн бодисReagent Co., Ltd. | 20040618 |
| Трихлора цууны хүчил | Синопарм химийн бодисReagent Co., Ltd. | 80132618 |
| Натрийн ацетат | Синопарм химийн бодисReagent Co., Ltd. | 10018818 |
| Цууны хүчил | Синопарм химийн бодисReagent Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | Синопарм химийн бодисReagent Co., Ltd. | 10011018 |
| Натрийн карбонат | Синопарм химийн бодисReagent Co., Ltd. | 10019260 |
| Фолин-фенол | Sangon Biotech (Шанхай)Ltd. Co., | A500467-0100 |
| L-тирозин | Сигма | 93829 |
Урвалж I:
Субстрат: Үхрийн сүүний уусмалаас 1% казеин: 1г үхрийн сүүний казеиныг 50мл 0.1М натрийн фосфатын уусмалд уусгаж, рН 8.0, усан ваннд 65-70°С-т 15 минут халааж, хутгаж уусгаж, усаар хөргөж, тохируулна. натрийн гидроксидыг рН 8.0 хүртэл, 100 мл хүртэл шингэлнэ.
Урвалж II:
TCA уусмал: 0.1M трихлорацетик хүчил, 0.2М натрийн ацетат, 0.3М цууны хүчил (1.64г гурвалжин цууны хүчил + 1.64г натрийн ацетат + 1.724мл цууны хүчил жинлэнэ, дараалан 50мл ионгүйжүүлсэн ус нэмээд pH3, H3-т шингэлнэ. 100 мл).
Урвалж III:
0.4м натрийн карбонатын уусмал (4.24г усгүй натрийн карбонатыг жинлээд 100мл усанд уусгана)
Урвалж IV:
Фолин фенолын урвалж: ионгүйжүүлсэн усаар 5 удаа шингэлнэ.
Урвалж V:
Ферментийн шингэрүүлэгч: 0.1 М натрийн фосфатын уусмал, рН 8.0.
Урвалж VI:
L-тирозин стандарт уусмал: 0, 0.005, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 umol/ml L-тирозиныг 0.2M HCl-ээр уусгана.
Процедур
1. UV-Vis спектрофотометрийг асаагаад фотометрийн хэмжилтийг сонгоно.
2. Долгионы уртыг 660нм гэж тохируулна уу.
3. Усан баннаа асааж, температурыг 37℃ болгож, 3-5 минутын турш температурыг хэвээр үлдээнэ.
4. 0.5 мл субстратыг 2 мл центрифугийн хоолойд 37 ℃ усан ваннд 10 минутын турш урьдчилан халаана.
5. Урьдчилан халаасан центрифугийн хоолойд 0.5 мл шингэрүүлсэн ферментийн уусмалыг 10 минутын турш гаргаж авна.Фермент шингэлэгчийг хоосон бүлэг болгон тохируулна уу.
6. Урвалын дараа 1.0 мл TCA урвалж нэмнэ.Сайн хольж, усан ваннд 30 минут байлгана.
7. Центрифуг хийх урвалын уусмал.
8. Дараах бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг заасан дарааллаар нэмнэ.
| Урвалж | Эзлэхүүн |
| Супернатант | 0.5 мл |
| 0.4М натрийн карбонат | 2.5 мл |
| Фолин фенолын урвалж | 0.5 мл |
9. 37℃-ийн усан ваннд 30 минутын турш өсгөвөрлөхийн өмнө сайтар холино.
10. ОД660ОД гэж тодорхойлсон1;хоосон хяналтын бүлэг: OD тодорхойлохын тулд ферментийн уусмалыг орлуулахын тулд фермент шингэрүүлэгчийг ашигладаг660ОД гэж2, ΔOD=OD1-ОД2.
11. L-тирозин стандарт муруй: 0.5мл өөр концентрацитай L-тирозин уусмал, 2.5мл 0.4М натрийн карбонат, 5мл центрифугийн хоолойд 0.5мл фолин фенолын урвалж, 37℃-т 30 минутын турш өсгөвөрлөж, ОД-ыг илрүүлнэ.660L-тирозины янз бүрийн концентрацийн хувьд Y=kX+b стандарт муруйг олж авсан бөгөөд Y нь L-тирозины концентраци, X нь OD юм.600.
Тооцоолол
2: Урвалын уусмалын нийт эзэлхүүн (мл)
0.5: Ферментийн уусмалын хэмжээ (мл)
0.5: Хромогенийг тодорхойлоход ашигласан шингэний урвалын хэмжээ (мл)
10: Урвалын хугацаа (мин)
Df: Олон дахин шингэлэх
C: Ферментийн концентраци (мг/мл)
Зураг
Зураг 1 ДНХ-ийн үлдэгдэл
| Дээж | Ave C4 | Нуклейн хүчил Сэргээх (пг/мг) | Сэргээх(%) | Нийт нуклейн хүчил ( пг/мг) |
| PRK | 24.66 | 2.23 | 83% | 2.687 |
| PRK+STD2 | 18.723 | 126.728 | - | - |
| STD1 | 12.955 |
- |
- |
- |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26.625 | |||
| РНХ агуулаагүй H2O | Тодорхойгүй | - | - | - |
Зураг.2 Хамгийн оновчтой рН
Зураг 3 Хамгийн оновчтой температур
Зураг.4 рН-ийн тогтвортой байдал
Зураг 5 Дулааны тогтвортой байдал
Зураг.6 25℃ температурт хадгалах тогтвортой байдал
