Робустарт Так ДНХ полимераз
Robustart Taq ДНХ Полимераз бол халуун эхлэлийн ДНХ полимераз юм.Энэхүү бүтээгдэхүүн нь ПГУ-ын системийг бэлтгэх, олшруулах явцад праймерын өвөрмөц бус задралаас үүдэлтэй өвөрмөц бус урвалыг дарангуйлж чаддаггүй.Тиймээс энэ нь маш сайн өвөрмөц шинж чанартай бөгөөд бага концентрацитай загваруудыг олшруулахад илүү үр дүнтэй байдаг бөгөөд энэ нь олон талт ПГУ-ын олшруулах урвалд тохиромжтой.Түүнчлэн, энэ бүтээгдэхүүн нь маш сайн хэрэглэх чадвартай бөгөөд ПГУ-ын янз бүрийн төрлийн урвалын үр дүнд тогтвортой олшруулалтыг авах боломжтой.
Бүрэлдэхүүн хэсгүүд
1.5 U/μL Robustart Taq ДНХ полимераза
2.10 × ПГУ-ын буфер II (Mg²+ үнэгүй) (заавал биш)
3.25 мМ MgCl2(заавал биш)
* 10 × PCR Buffer II (Mg²+ free) нь dNTP болон Mg²+ агуулаагүй тул dNTP болон MgCl нэмнэ үү.2урвалын системийг бэлтгэх үед.
Санал болгож буй програмууд
1.Хурдан олшруулалт.
2.Олон тооны олшруулалт.
3.Цус, арчдас болон бусад дээжийг шууд олшруулах.
4.Амьсгалын замын өвчнийг илрүүлэх.
Хадгалах нөхцөл
-20°С-д удаан хугацаагаар хадгалах, хэрэглэхийн өмнө сайтар хольж, хөлдөөх, гэсгээхээс зайлсхийх хэрэгтэй.
*Хөргөлтийн дараа хур тунадас орсон бол энэ нь хэвийн;Холих, хэрэглэхийн өмнө өрөөний температурт тэнцвэржүүлэхийг зөвлөж байна.
Нэгжийн тодорхойлолт
Нэг идэвхтэй нэгж (U) нь 10 нмоль дезоксирибонуклеотидыг хүчилд уусдаггүй материалд 74°С-т 30 минутын турш идэвхжүүлсэн хулд загасны эр бэлгийн эсийн ДНХ-г загвар/праймер болгон шингээх ферментийн хэмжээг хэлнэ.
Чанарын шалгалт
1.SDS-PAGE электрофоретик цэвэршилт 98%-иас дээш.
2.Олшруулах мэдрэмж, багцаас багцын хяналт, тогтвортой байдал.
3.Экзоген нуклеазын идэвхжил байхгүй, экзоген эндонуклеаз эсвэл экзонуклеазын бохирдол байхгүй
Зааварчилгаа
Урвалын тохиргоо
| Бүрэлдэхүүн хэсгүүд | Эзлэхүүн (мкЛ) | Эцсийн концентраци |
| 10 × ПГУ-ын буфер II (Mg²+ үнэгүй)a | 5 | 1× |
| dNTPs (dNTP тус бүр 10мМ) | 1 | 200 мкм |
| 25 мМ MgCl2 | 2-8 | 1-4 мм |
| Robustart Taq ДНХ Полимераз (5U/μL) | 0.25-0.5 | 1.25-2.5 U |
| 25 × Праймер хольцб | 2 | 1× |
| Загвар | - | ＜ 1 мкг / урвал |
| ddH2O | 50 хүртэл | - |
Тэмдэглэл:
1) а.Буферт dNTP болон Mg²+ агуулаагүй тул dNTP болон MgCl нэмнэ үү2урвалын системийг бэлтгэх үед.
2) б.Хэрэв qPCR/qRT-PCR-д ашигласан бол флюресцент датчикийг урвалын системд нэмнэ.Ихэвчлэн праймерын эцсийн концентраци 0.2 μM нь сайн үр дүнг өгдөг;хэрэв урвалын гүйцэтгэл муу байвал праймерын концентрацийг 0.2-1 μM-ийн хүрээнд тохируулж болно.Сорьцын концентрацийг ихэвчлэн 0.1-0.3 μM-ийн хүрээнд оновчтой болгодог.Праймер болон датчикийн хамгийн сайн хослолыг олохын тулд концентрацийн градиент туршилтыг хийж болно.
Дулааны дугуйн протокол
| Тогтмол ПГУүйл явц | |||
| Алхам | Температур | Цаг хугацаа | Цикл |
| Урьдчилан денатураци | 95℃ | 1-5 минут | 1 |
| Денатураци | 95℃ | 10-20 сек | 40-50 |
| Хагалах / Өргөтгөх | 56-64 хэм байна | 20-60 сек | |
| Түргэн ПГУүйл явц | |||
| Алхам | Температур | Цаг хугацаа | Цикл |
| Урьдчилан денатураци | 95℃ | 30 сек | 1 |
| Денатураци | 95℃ | 1-5 сек | 40-45 |
| Хагалах / Өргөтгөх | 56-64 хэм байна | 5-20 сек | |
Тэмдэглэл
1.Хурдан ДНХ полимеразын олшруулалтын хурд 1 кб/10 секундээс багагүй байх ёстой.Төрөл бүрийн ПГУ-ын төхөөрөмжүүдийн температурын өсөлт, бууралтын хурд, температурын хяналтын горим, дулаан дамжуулалтын үр ашиг нь ихээхэн ялгаатай байдаг тул тодорхой хурдан ПГУ-ын багажийн урвалын оновчтой нөхцлийг оновчтой болгохыг зөвлөж байна.
2.Систем нь дасан зохицох чадвар сайтай, өндөр өвөрмөц чанар, мэдрэмжтэй байдаг.
3.Өндөр мэдрэмжтэй ПГУ илрүүлэх урвалж болгон ашиглахад тохиромжтой, ПГУ-ын мультиплекс олшруулах урвалд ашиглаж болно.
4.5′→3′ полимеразын идэвх, 5′→3′ экзонуклеазын идэвх;3′→5′ экзонуклеазын идэвхгүй;засварлах функц байхгүй.
5.ПГУ болон RT-ПГУ-ын чанарын болон тоон шинжилгээнд тохиромжтой.
6.ПГУ-ын бүтээгдэхүүний 3′ төгсгөл нь А бөгөөд үүнийг шууд Т вектор болгон хувилах боломжтой.
7.Гурван үе шаттай аргыг бага температуртай праймер эсвэл 200 bp-ээс урт фрагментийг өсгөхөд ашиглахыг зөвлөж байна.
