Proteinase K mNGS (шингэн)
Proteinase K нь өргөн субстратын өвөрмөц шинж чанартай тогтвортой серин протеаз юм.Энэ нь угаалгын нунтаг байгаа ч гэсэн төрөлх төлөв байдалд олон уургийг задалдаг.Кристал болон молекулын бүтцийн судалгаагаар фермент нь идэвхтэй талбайн каталитик гурвал (Asp) бүхий субтилизин гэр бүлд хамаардаг болохыг харуулж байна.39- Түүний69-Сэр224).Хагарлын зонхилох газар нь блоклогдсон альфа амин бүлгүүдтэй алифат болон үнэрт амин хүчлүүдийн карбоксил бүлгийн зэргэлдээ пептидийн холбоо юм.Энэ нь өргөн цар хүрээтэй өвөрмөц шинж чанараараа ашиглагддаг.Энэхүү протеиназа К нь mNGS-д тусгайлан зориулагдсан.Бусад протеиназа К-тэй харьцуулахад энэ нь ижил ферментийн гүйцэтгэлтэй нуклейн хүчлийн бохирдол багатай байдаг нь mNGS-ийн доод урсгалыг илүү сайн хангаж чадна.
Хадгалах нөхцөл
2-8 хэмийн температурт 2 жил
Тодорхойлолт
| Гадаад төрх | Өнгөгүй цайвар хүрэн шингэн |
| Үйл ажиллагаа | ≥800 U/мл |
| Уургийн концентраци | ≥20 мг/мл |
| Никас | Аль нь ч илрээгүй |
| ДНаз | Аль нь ч илрээгүй |
| RNase | Аль нь ч илрээгүй |
Үл хөдлөх хөрөнгө
| EC дугаар | 3.4.21.64(Tritirachium цомгийн рекомбинант) |
| Изоэлектрик цэг | 7.81 |
| Хамгийн оновчтой рН | 7.0- 12.0 Зураг 1 |
| Хамгийн оновчтой температур | 65 ℃ Зураг 2 |
| рН-ийн тогтвортой байдал | рН 4.5- 12.5 (25 ℃, 16 цаг) Зураг 3 |
| Дулааны тогтвортой байдал | 50 ℃-аас доош (рН 8.0, 30 мин) Зураг 4 |
| Хадгалалтын тогтвортой байдал | 25 ℃ температурт 12 сарын хугацаанд 90% гаруй идэвхжилтэй |
| Идэвхжүүлэгчид | SDS, мочевин |
| Дарангуйлагчид | Диизопропил фторфосфат;фенилметилсульфонил фтор |
Хэрэглээ
1. Генетикийн оношлогооны иж бүрдэл
2. РНХ ба ДНХ олборлох иж бүрдэл
3. Уургийн бус бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг эд эсээс гаргаж авах, ДНХ зэрэг уургийн хольцыг задлахвакцин ба гепарин бэлтгэх
4. Импульсийн электрофорезийн аргаар хромосомын ДНХ бэлтгэх
5. Баруун толбо
6. In vitro оношлогоонд ферментийн гликозилжүүлсэн альбумин урвалжууд
Урьдчилан сэргийлэх
Ашиглах, жинлэх үед хамгаалалтын бээлий, нүдний шил зүүж, хэрэглэсний дараа агааржуулалт сайтай байлгана.Энэ бүтээгдэхүүн нь арьсны харшлын урвал, нүдийг цочрооход хүргэдэг.Хэрэв амьсгалсан бол харшил, астма, амьсгал давчдах шинж тэмдэг илэрч болно.Амьсгалын замын цочрол үүсгэж болзошгүй.
Нэгжийн тодорхойлолт
Нэг нэгж (U) нь 1 мкмоль үйлдвэрлэхийн тулд казеиныг гидролиздэхэд шаардагдах ферментийн хэмжээ гэж тодорхойлогддог.Дараах нөхцөлд минутанд тирозин.
Урвалж бэлтгэх
Урвалж I: 1 г сүүний казеиныг 50 мл 0.1 М натрийн фосфатын уусмалд (рН 8.0) уусгаж, 65-70 ℃ усанд 15 минутын турш өсгөвөрлөж, хутгаж, уусгаж, усаар хөргөж, натрийн гидроксидоор рН 8.0 хүртэл тохируулж, тогтооно. 100 мл.
Урвалж II: 0.1М трихлорацетик хүчил, 0.2М натрийн ацетат, 0.3М цууны хүчил.
Урвалж III: 0.4M Na2CO3шийдэл.
Урвалж IV: Forint урвалжийг 5 удаа цэвэр усаар шингэлнэ.
Урвалж V: Фермент шингэрүүлэгч: 0.1М натрийн фосфатын уусмал (рН 8.0).
Урвалж VI: тирозины уусмал: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 умол/мл тирозиныг 0,2-ээр уусгасан.M HCl.
Процедур
1. 0.5мл урвалж I-г 37℃ хүртэл халааж, 0.5мл ферментийн уусмал нэмээд сайтар хольж, температурт өсгөвөрлөнө.37 хэмд 10 минут байлгана.
2. Урвалыг зогсоохын тулд 1 мл урвалж II нэмээд сайтар хольж, 30 минутын турш инкубацийг үргэлжлүүлнэ.
3. Центрифуг хийх урвалын уусмал.
4. 0.5мл дээд давхаргыг авч 2.5мл урвалж III, 0.5мл урвалж IV нэмээд сайтар хольж, 37℃ температурт өсгөвөрлөнө.30 минутын турш.
5. ОД660ОД гэж тодорхойлсон1;хоосон хяналтын бүлэг: 0.5 мл урвалж V нь ферментийг орлуулахад ашиглагддагOD тодорхойлох шийдэл660ОД гэж2, ΔOD=OD1-ОД2.
6. L-тирозин стандарт муруй: 0.5мл өөр концентрацитай L-тирозин уусмал, 2.5мл урвалж III, 0.5мл урвалж IV 5мл центрифугийн хоолойд, 37℃-т 30 минутын турш өсгөвөрлөж, OD-ийг илрүүлнэ.660L-тирозины өөр өөр концентрацийн хувьд Y=kX+b стандарт муруйг олж авсан бөгөөд Y нь L-тирозины концентраци, X нь OD юм.600.
Тооцоолол
2: Урвалын уусмалын нийт эзэлхүүн (мл)
0.5: Ферментийн уусмалын хэмжээ (мл)
0.5: Хромогенийг тодорхойлоход ашигласан шингэний урвалын хэмжээ (мл)
10: Урвалын хугацаа (мин)
Df: Олон дахин шингэлэх
C: Ферментийн концентраци (мг/мл)
Лавлагаа
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Биофиз.Res.Коммун.(1971);44:513.
3. Хилз, Х.болон бусад.евро.J. Биохим.(1975);56:103–108.
4. Самбрук Жet бусад, Молекулын клонжуулалт: Лабораторийн гарын авлага, 2-р хэвлэл, Хүйтэн хаврын боомтЛабораторийн хэвлэл, Хүйтэн хаврын боомт (1989).
Зураг
Зураг.1 Хамгийн оновчтой pH
100мМ буфер уусмал: рН6.0-8.0, Na-фосфат;pH8.0-9.0, Tris-HCl;рН9.0-12.5, Глицин-NaOH.Ферментийн концентраци:1мг/мл
Зураг 2 Хамгийн оновчтой температур
20 мМ К-фосфатын буфер дэх урвал рН 8.0.Ферментийн концентраци: 1 мг/мл
Зураг.3 рН Тогтвортой байдал
25 ℃, 50 мм буфер уусмалаар 16 цаг эмчилгээ: рН 4.5- 5.5, ацетат;рН 6.0-8.0, Na-фосфат;рН 8.0-9.0, Tris-HCl.рН 9.0-12.5, Глицин-NaOH.Ферментийн концентраци: 1 мг/мл
Зураг 4 Дулааны тогтвортой байдал
50 мм Tris-HCl буфер, рН 8.0 бүхий 30 минутын эмчилгээ.Ферментийн концентраци: 1 мг/мл
Зураг 5 Хадгалалт тогтвортойty at 25℃
