RTL урвуу транскриптаза
RTL урвуу транскриптаза нь РНХ загвараас хамааралтай ДНХ полимераза бөгөөд 3'→5' экзонуклеазын идэвхгүй, RNase H идэвхжилтэй.Энэ фермент нь РНХ-ийг ДНХ-ийн нэмэлт хэлхээг нийлэгжүүлэх загвар болгон ашиглах боломжтой бөгөөд үүнийг эхний хэлхээний cDNA нийлэгжилтэнд, ялангуяа RT-LAMP (гогцоонд зуучлагдсан изотермийн олшруулалт)-д хэрэглэж болно.RTL урвуу транскриптаз 1.0-тэй харьцуулахад мэдрэмж нь мэдэгдэхүйц сайжирч, дулааны тогтвортой байдал нь илүү хүчтэй, 65 ° C-д урвал илүү тогтвортой байдаг.RTL урвуу транскриптаза (глицеролгүй) нь лиофилжсэн бэлдмэл, лиофилжсэн RT-LAMP урвалж гэх мэтийг бэлтгэхэд ашиглаж болно.
Нэгжийн тодорхойлолт
Нэг нэгж нь поли(A)•oligo(dT)25-ыг загвар-праймер болгон ашиглан 50°С-т 20 минутын дотор хүчилд тунадасжих материалд 1 нмоль dTTP-ийг шингээдэг.
Бүрэлдэхүүн хэсгүүд
| Бүрэлдэхүүн хэсэг | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL урвуу транскриптаза (Глицеролгүй) (15U/мкл) | 0.1 мл | 1 мл | 10 мл |
| 10×HC RTL буфер | 1.5 мл | 4×1.5 мл | 5х10 мл |
| MgSO4 (100мМ) | 1.5 мл | 2 × 1.5 мл | 3х10 мл |
Хадгалах нөхцөл
0°С-аас доош температурт тээвэрлэж, -25°C~-15°C хэмд хадгална.
Чанарын шалгалт
- Үлдэгдэл үйл ажиллагааEдонуклеаз:1 мкг λДНХ, 15 нэгж RTL2.0 агуулсан 50 мкл-ийн урвалыг 37 хэмд 16 цагийн турш өсгөвөрлөсөн нь гель электрофорезийн сөрөг хяналттай ижил хэв маягийг харуулж байна.
- Үлдэгдэл үйл ажиллагааЭкзонуклеаз:1 мкг Hind Ⅲ задаргаатай λDNA, 15 нэгж RTL2.0 агуулсан 50 мкл-ийн урвал нь 37 ℃ температурт 16 цагийн турш инкубацийн гель электрофорезийн сөрөг хяналттай ижил хэв маягийг харуулж байна.
- Үлдэгдэл үйл ажиллагааНикас:1 мкг хэт ороомогтой pBR322 ба 15 нэгж RTL2.0 агуулсан 50 мкл-ийн урвалыг 37°С-т 4 цагийн турш өсгөвөрлөсөн нь гель электрофорезийн сөрөг хяналттай ижил загварыг харуулж байна.
- Үлдэгдэл үйл ажиллагааRNase:0.48 мкг MS2 РНХ, 15 нэгж RTL2.0 агуулсан 10 мкл-ийн урвалыг 37°С-т 4 цагийн турш өсгөвөрлөсөн нь гель электрофорезийн сөрөг хяналттай ижил загварыг харуулж байна.
- E. coli gДНХ:-аар хэмжсэнE.coliтодорхой HCD илрүүлэх иж бүрдэл，15 нэгж RTL2.0 нь 1-ээс бага хэмжээтэй байнаE. coliгеном.
Урвалын тохиргоо
cDNA синтезийн протокол
| Бүрэлдэхүүн хэсгүүд | Эзлэхүүн |
| Загвар РНХ a | сонголттой |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) эсвэл Random Primer mix(60uM) | 2 мкл |
| dNTP холимог (тус бүр 10мМ) | 1 мкл |
| RNase дарангуйлагч (40U/uL) | 0.5 мкл |
| RTL урвуу транскриптаза 2.0 (15U/uL) | 0.5 мкл |
| 10×HC RTL буфер | 2 мкл |
| Нуклеазгүй ус | 20 мкл хүртэл |
Тэмдэглэл:
1) Нийт РНХ-ийн санал болгож буй тун нь 1ng~1μg байна
2) mRNA-ийн санал болгож буй тун нь 50ng~100ng байсан
Thermo-дугуй унах Тогтмол дасгал хийх нөхцөл хариу үйлдэл:
| Температур (°C) | Цаг хугацаа |
| 25 ° Ca | 5мин |
| 55 ° C | 10 минb |
| 80 ° C | 10 мин |
Тэмдэглэл:
1) Хэрэв санамсаргүй праймер хольцыг хэрэглэвэл 25°C температурт инкубацийн алхам хийнэ.
2) Хэрэв зорилтот праймерын хольцыг хэрэглэвэл 55°С-т 10-30 минутын турш инкубацийн алхам хийнэ.
RT-LAMP протокол
| Бүрэлдэхүүн хэсгүүд | Эзлэхүүн | Эцсийн концентраци |
| Загвар РНХ | сонголттой | ≥10 хувь |
| dNTP холимог (10мМ) | 3.5 мкл | 1.4 мм |
| FIP/BIP праймер (25×) | 1 мкл | 1.6 мкм |
| F3/B3 праймер (25×) | 1 мкл | 0.2 мкм |
| LoopF/LoopB праймер (25×) | 1 мкл | 0.4 мкм |
| RNase дарангуйлагч (40U/μл) | 0.5 мкл | 20 U/Reaksiyon |
| RTL урвуу транскриптаза 2.0 (15U/μL) | 0.5 мкл | 7.5 U/Reaksiyon |
| Bst V2 ДНХ Полимераз (8U/μL) | 1 мкл | 8 U/Reaksiyon |
| MgSO4 (100мМ) | 1.5 мкл | 6 мм (Нийт 8 мм) |
| 10×HC RTL буфер (эсвэл 10×HC Bst V2 буфер) | 2.5 мкл | 1 × (2мМ Mg2+) |
| Нуклеазгүй ус | 25 мкл хүртэл | - |
Тэмдэглэл:
1) Цуглуулахын тулд эргүүлэх замаар хольж, богино хугацаанд центрифуг хийнэ.Тогтмол температурт 65 хэмд 1 цагийн турш өсгөвөрлөнө.
2) Хоёр буфер нь харилцан ажиллах боломжтой бөгөөд ижил найрлагатай.
Тэмдэглэл
1. Энэ бүтээгдэхүүнийг -20 ° C-т хадгалахад цагаан цул үүснэ.-20 хэмээс гаргаж аваад мөсөн дээр 10 минут орчим байлгана.Хайлсны дараа сэгсэрч холих замаар хэрэглэж болно.
2. cDNA-ийн бүтээгдэхүүнийг -20°C эсвэл -80°C хэмд хадгалах эсвэл ПГУ-ын урвалд нэн даруй ашиглаж болно.
3. RNase бохирдлоос урьдчилан сэргийлэхийн тулд туршилтын талбайг цэвэр байлгаж, ажлын явцад цэвэр бээлий, амны хаалт зүүнэ үү.
