Хулганы генотипийн хэрэгсэл

Муур дугаар: HCR2021A

Энэхүү бүтээгдэхүүн нь ДНХ-ийн түүхий олборлолт, ПГУ-ын олшруулах системийг багтаасан хулганы генотипийг хурдан тодорхойлох зориулалттай иж бүрдэл юм.Бүтээгдэхүүнийг хулганын сүүл, чих, хөлийн хуруу болон бусад эд эсээс Lysis Buffer болон Proteinase k-ийн энгийн задралын дараа шууд ПГУ-ын өсгөвөрлөхөд ашиглаж болно.Шөнийн турш задаргаа хийхгүй, фенол-хлороформыг гаргаж авах, багана цэвэршүүлэх нь энгийн бөгөөд туршилтын цагийг богиносгодог.Бүтээгдэхүүн нь 2 кб хүртэлх зорилтот фрагментуудыг олшруулах, 3 хүртэлх хос праймер бүхий ПГУ-ын мультиплекс урвалыг хийхэд тохиромжтой.2× Mouse Tissue Direct PCR Mix нь генетикийн аргаар боловсруулсан ДНХ полимераза, Mg агуулсан.²⁺, dNTPs ба оновчтой буфер систем нь олшруулагчийн өндөр үр ашиг, дарангуйлагчийг тэсвэрлэх чадвартай тул загвар, праймер нэмж, бүтээгдэхүүнийг 1 × хүртэл шингэнээр дүүргэх замаар ПГУ-ын урвал явуулах боломжтой.Энэ бүтээгдэхүүнээр олшруулсан ПГУ-ын бүтээгдэхүүн нь 3′ төгсгөлд тод томруун “А” суурьтай бөгөөд цэвэршүүлсний дараа ТТ клончлоход шууд ашиглаж болно.

Бүрэлдэхүүн хэсгүүд

Хадгалах нөхцөл

Бүтээгдэхүүнийг -25~-15 хэмд 2 жил хадгална.Гэсгээсний дараа Lysis Buffer-ийг богино хугацаанд олон удаа хэрэглэхийн тулд 2~8℃ хэмд хадгалах ба хэрэглэх үед сайтар холино.

Өргөдөл

Энэ бүтээгдэхүүн нь хулгана нокаут шинжилгээ, трансген илрүүлэх, генотип тогтоох гэх мэтэд тохиромжтой.

Онцлогууд

1.Энгийн ажиллагаа: геномын ДНХ гаргаж авах шаардлагагүй;

2.Өргөн хэрэглээ: янз бүрийн хулганы эдийг шууд өсгөхөд тохиромжтой.

Зааварчилгаа

1.Геномын ДНХ-ийн ялгарал

1) Лизат бэлтгэх

Эдийн лизатыг задлах хулганын дээжийн тоогоор (эдийн лизатыг газар дээр нь тунгийн дагуу бэлтгэж, хэрэглэхийн тулд сайтар холино) бэлтгэдэг ба нэг дээжинд шаардагдах урвалжийн эзлэх хувь дараах байдалтай байна.

2) Дээж бэлтгэх ба задрал

Зөвлөмж болгож буй эдийн хэрэглээ

Цэвэр центрифугийн хоолойд хулганы эдийн дээжийг зохих хэмжээгээр авч, центрифугийн хоолой бүрт 200 мкл шинэ эдийн лизат нэмж, эргүүлээд сэгсэрсний дараа 55 хэмд 30 минутын турш өсгөвөрлөсний дараа 98 хэмд 3 минут халаана.

3) Центрифуг хийх

Лизатыг сайтар сэгсэрч, 5 минутын турш 12000 эрг/мин-д центрифуг хийнэ.Супернатантыг ПГУ-ын олшруулалтын загвар болгон ашиглаж болно.Хэрэв загвар хадгалахад шаардлагатай бол дээд давхаргыг өөр ариутгасан центрифугийн хоолой руу шилжүүлж, -20 хэмд 2 долоо хоног хадгална.

2.ПГУ-ын олшруулалт

2 × хулганы эдийн шууд ПГУ-ын хольцыг -20 хэмээс аваад мөсөн дээр гэсгээж, дээрээс нь доош нь хольж, дараах хүснэгтийн дагуу ПГУ-ын урвалын системийг бэлтгэ (мөсөн дээр ажиллана):

Жич:

a) Нэмэгдсэн хэмжээ нь системийн 1/10-ээс хэтрэхгүй байх ёстой бөгөөд хэрэв хэт их нэмбэл ПГУ-ын олшруулалтыг саатуулж болно.

Зөвлөмж болгож буй ПГУ-ын нөхцөл

Жич:

a) Хуурайшуулах температур: Праймерын Tm-ийн утгыг харгалзан зөөлрүүлэх температурыг праймерын бага Tm утгаар +3~5℃ болгохыг зөвлөж байна.

Нийтлэг асуудал ба шийдэл

1.Зорилтот зурвас байхгүй

1) Хэт их задралын бүтээгдэхүүн.Системийн 1/10-аас ихгүй байх хамгийн тохиромжтой загварыг сонгох;

2) Хэт том түүврийн хэмжээ.Лизатыг 10 удаа шингэлж, дараа нь олшруулж, эсвэл дээжийн хэмжээг багасгаж, дахин задлах;

3) Эд эсийн дээж шинэхэн биш.Шинэхэн эд эсийн дээжийг ашиглахыг зөвлөж байна;

4) Праймерын чанар муу.Праймерын чанарыг шалгах, праймер дизайныг оновчтой болгохын тулд олшруулалтад геномын ДНХ-г ашиглана.

2.Өвөрмөц бус олшруулалт

1) Хатаах температур хэт бага, мөчлөгийн тоо хэт өндөр байна.Хатаах температурыг нэмэгдүүлж, мөчлөгийн тоог багасгах;

2) Загварын концентрац хэт өндөр байна.Загварын хэмжээг багасгах эсвэл олшруулсны дараа загварыг 10 удаа шингэлэх;

3) Праймерын өвөрмөц чанар муу.Праймер дизайныг оновчтой болгох.

Тэмдэглэл

1.Дээж хоорондын бохирдлоос зайлсхийхийн тулд дээж авах олон багаж бэлтгэх шаардлагатай бөгөөд хэрэв дахин ашиглах шаардлагатай бол дээж бүрийн дараа 2% натрийн гипохлоритын уусмал эсвэл нуклейн хүчил цэвэрлэгчээр багажийн гадаргууг цэвэрлэж болно.

2.Хулганы шинэ эдийг ашиглахыг зөвлөж байна, олшруулалтын үр дүнд нөлөөлөхгүйн тулд дээж авах хэмжээ хэт том байх ёсгүй.

3.Lysis Buffer нь байнга хөлдөөх, гэсэхээс зайлсхийх ёстой бөгөөд богино хугацаанд олон удаа хэрэглэхэд 2 ~ 8 ℃ хэмд хадгалах боломжтой.Хэрэв бага температурт хадгалвал хур тунадас үүсч болзошгүй тул хэрэглэхийн өмнө бүрэн ууссан байх ёстой.

4.ПГУ-ын хольцыг байнга хөлдөөх, гэсгээхээс зайлсхийх хэрэгтэй бөгөөд богино хугацаанд давтан хэрэглэхэд 4 хэмд хадгална.

5.Энэхүү бүтээгдэхүүн нь зөвхөн шинжлэх ухааны туршилтын судалгаанд зориулагдсан тул эмнэлзүйн оношлогоо, эмчилгээнд хэрэглэх ёсгүй.