Ургамлын шууд ПГУ-ын иж бүрдэл

Муур дугаар: HCR2020A

Plant Direct PCR Kit нь ургамлын навч, үр гэх мэтийг шууд олшруулахад тохиромжтой бөгөөд полисахарид, полифенол агуулаагүй ургамлын дээжийг өндөр үр дүнтэй скрининг хийхэд ашиглаж болно.Зориулалтын хувьсал дээр суурилсан ДНХ-ийн полимеразын шууд олшруулалт нь ургамлын ПГУ-ын дарангуйлагчдад илүү тэсвэртэй байдаг.Үүний зэрэгцээ, энэ нь 5 кб доторх ДНХ-ийн хэсгүүдийг олшруулахад тохиромжтой олшруулалтын өндөр гүйцэтгэлийг хадгалж байдаг.Иж бүрдэл дэх өвөрмөц Lysis буфер А нь шинэхэн эсвэл хөлдөөсөн ургамлын эдийг задлахад ашиглаж болно.Энэ нь ажиллахад хялбар бөгөөд лизатыг цэвэршүүлэхгүйгээр олшруулах загвар болгон ашиглаж болно.Энэхүү систем нь түүхий дээжийг олон удаа хөлдөөж, гэсгээсний дараа үр дүнтэй өсгөх боломжийг олгодог хамгаалалтын бодис агуулдаг.2 × Plant Direct Master Mix нь олшруулах урвалыг гүйцэтгэхийн тулд зөвхөн праймер болон загваруудыг нэмэхэд л хангалттай бөгөөд ингэснээр питинг хийх ажиллагааг багасгаж, илрүүлэх чадвар болон үр дүнгийн давтагдах чадварыг сайжруулна.

Бүрэлдэхүүн хэсгүүд

* Ургамлын шууд задралын буфер В нь дээжийг хадгалах хугацааг уртасгахын тулд ургамлын шууд задралын буфер А-г саармагжуулахад ашигладаг нэмэлт урвалж юм.Үүнийг бодит нөхцөл байдлын дагуу ашиглаж болно.

Хадгалах нөхцөл

2 × Ургамлын шууд мастер хольцыг -30 ~ -15 ℃ хэмд хадгалж, дахин хөлдөөх, гэсгээхээс зайлсхийх;Ургамлын шууд задралын буфер, -30 ~ -15 ℃ эсвэл 2 ~ 8 ℃ хэмд хадгална.

Туршилтын үйл явц

Дээж боловсруулах–Ургамлын навч

Шууд арга:Залуу навчийг ашиглахыг зөвлөж байна.Жижиг, жигд дээж авахын тулд 0.5-3 мм-ийн тогтмол диаметртэй цоолбор ашиглан, дараа нь дээжийг ПГУ-ын системд шууд нэмнэ (50 мкл системийг санал болгож байна).Дээж нь хоолойн хананд биш, ПГУ-ын уусмалд байгаа эсэхийг анхаарна уу.Хэрэв шууд ПГУ-ыг урт хэлтэрхий болон нарийн төвөгтэй дээжийг өсгөхөд ашигладаг бол жижиг диаметртэй (0.5 - 1 мм) дээжийг загвар болгон ашиглах нь илүү сайн үр дүнд хүрэхэд тусална.

Нунтаглах задралын арга:Залуу навчийг ашиглахыг зөвлөж байна.Навчны жижиг хэсгийг (ойролцоогоор 1-3 мм диаметртэй) аваад 20 мкл Plant Direct Lysis Buffer Ab-д хийж, аль болох их хэмжээгээр нунтаглана (энэ алхамыг 100 мкл пипеткийн үзүүрээр навчийг шахаж хийж болно. дээжийг бутлах).Хэрэв навчны эдийг их хэмжээгээр хэрэглэж байгаа бол (7 мм-ээс ихгүй) шингэлэх буферийн хэмжээг 50 мкл хүртэл нэмэгдүүлнэ.Навчийг нунтагласны дараа уусмал нь ногоон өнгөтэй байх ёстой.Богино центрифуг хийсний дараа 1 мкл супернатантыг ПГУ-ын системд урвалын загвар болгон нэмнэ.

Дулааны задралын арга:Залуу навчийг ашиглахыг зөвлөж байна.Навчны жижиг хэсгийг (ойролцоогоор 1-3 мм диаметртэй) авч, 20 мкл ургамлын шууд задралын буфер А-д хийж, 95 ° C-т 5-10 минутын турш халаана.Лизинг хийхэд хэцүү навчны хувьд задралын хугацааг зохих ёсоор сунгаж болно (20 минутаас илүүгүй).Хэрэв навчны эдийг их хэмжээгээр хэрэглэж байгаа бол (7 мм-ээс ихгүй) шингэлэх буферийн хэмжээг 50 мкл хүртэл нэмэгдүүлнэ.Халсаны дараа богино хугацаанд центрифуг хийж, 1 мкл супернатантыг ПГУ-ын системд урвалын загвар болгон нэмнэ.

Дээж боловсруулах- Ургамлын үр

Нунтаглах задралын арга:5 мм-ийн диаметртэй үрийг хусуур ашиглан зүсэж, 100 мкл ургамлын шууд задралын буфер А-д нэмж, соруур эсвэл бусад хэрэгслээр дээжийг нунтаглана.Богино хугацаанд эргүүлээд тасалгааны температурт 3-5 минут байлгана.Үрийн дээжийг шингэлэх буферт живүүлсэн эсэхийг шалгаарай.Богино хугацаанд центрифуг хийсний дараа 1 мкл супернатантыг ПГУ-ын системд урвалын загвар болгон нэмнэ.

Дулааны задралын арга:5 мм-ийн голчтой үрийг хусуураар зүсэж, 100 мкл Ургамлын шууд задралын буфер А-д нэмж, 95 ° C-т 5 - 10 минутын турш халаана.Лизинг хийхэд хэцүү навчны хувьд задралын хугацааг зохих ёсоор сунгаж болно (30 минутаас илүүгүй).Халсаны дараа богино хугацаанд центрифуг хийж, 1 мкл супернатантыг ПГУ-ын системд урвалын загвар болгон нэмнэ.

а.Тохиромжтой хэмжээтэй дээжийг зүсэхэд хайч эсвэл бусад хэрэгслийг ашиглаж болно;хэрэв цоолтуурын цоолтуур эсвэл хайчыг дахин ашигласан бол дээж хоорондын бохирдлоос сэргийлэхийн тулд тэдгээрийг хэрэглэх бүрийн өмнө 2% натрийн гипохлоритын уусмалаар цэвэрлэнэ.

б.Хэрэглэхийн өмнө ургамлын шууд задралын буфер бүрэн хайлсан эсэхийг шалгаарай.Хэрэв буфер нь наалдамхай эсвэл тунадастай байвал хэрэглэхийн өмнө 37 хэмд халааж, бүрэн хайлуулж болно.

в.Урвалын систем дэх загварын эзэлхүүнийг ургамлын материал болон нэмсэн шингэрүүлэгчийн эзэлхүүний зөрүүгээс хамаарч зохих ёсоор тохируулж болно.

Ургамлын шууд задралын буфер

Энэхүү бүтээгдэхүүнд агуулагдах Ургамлын шууд лизисын буфер А нь ихэнх ургамлын эд эсийн геномыг ялгаруулахын тулд нарийн оновчтой болсон бөгөөд түүхий ургамлыг 4 хэмд богино хугацаанд хадгалахад тохиромжтой.Хэрэв дээжийг удаан хугацаагаар (жишээлбэл, 1-2 сар) хадгалах шаардлагатай бол дээд давхаргыг шинэ EP хоолой руу шилжүүлж, -20 хэмд хадгалахыг зөвлөж байна.Дээжийг илүү тогтвортой хадгалахын тулд шилжүүлсэн дээд давхаргад ургамлын шууд задралын буфер В-ийг тэнцүү хэмжээгээр нэмээд сайтар хольж, -20 хэмд хадгална.Тогтвортой хадгалах хугацаа нь ургамлын дээж, төлөв байдлаас хамаарч өөр өөр байдаг.

Урвалын систем

а.Энэ нь Mg агуулдаг²⁺эцсийн концентрацид 2 мм.

б.Праймер бүрийн хувьд 0.4μM-ийн эцсийн концентрацийг ашиглахыг зөвлөж байна.Праймерыг хэт их хэрэглэх нь өвөрмөц бус олшруулалтыг нэмэгдүүлэхэд хүргэдэг.

в.Хэрэглэсэн дээжийн хэмжээг бодит нөхцөл байдлын дагуу тохируулж болно.Түүхий задарсан дээжийн нэг урвалд хэрэглэх хэмжээг урвалын нийт эзэлхүүний 2% - 20% хооронд тохируулж болно.Хэт их дээж ашиглах нь олшруулалтад алдаа гаргахад хүргэдэг.

Урвалын хөтөлбөр

а.Анхны денатураци (98 ℃, 5 минут) нь ургамлын эд эсийн задралыг дэмжиж, ПГУ-ын олшруулалтад ашиглаж болох геномын ДНХ-ийг ялгаруулдаг.Цагийг богиносгож, температурыг бууруулж болохгүй.

б.Үүнийг праймерын Tm утгатай тэнцүү эсвэл Tm утгаас 2 ~ 4℃ өндөр болгохыг зөвлөж байна.Энэ бүтээгдэхүүнд ашигладаг шууд олшруулах ДНХ полимераз нь ердийн Taq ДНХ полимеразаас ялгаатай бөгөөд урвалын температурт тусгай шаардлага тавьдаг; өндөр температурыг ашиглах нь өвөрмөц бус олшруулалтыг үр дүнтэй бууруулж, олшруулах үр ашгийг сайжруулдаг.Нарийн төвөгтэй загваруудын хувьд үр дүнтэй олшруулалтыг зөөлрүүлэх температурыг тохируулах, сунгах хугацааг уртасгах замаар хийж болно.

в.Хэрэв олшруулалтын бүтээгдэхүүний урт ≤1 кб бол сунгах хугацааг 30 сек/кб гэж тогтооно;хэрэв олшруулах бүтээгдэхүүний урт нь >1 кб бол сунгах хугацааг 60 сек/кб гэж тогтооно.

г.Нарийн төвөгтэй дээж эсвэл олшруулах гарц багатай дээжийн хувьд мөчлөгийн тоог 40-50 цикл хүртэл нэмэгдүүлэх боломжтой.

Хэрэглээ

Энэ нь ургамлын эд эсийг шууд олшруулах, полисахарид, полифенол агуулаагүй ургамлын дээжийг өндөр үр дүнтэй скрининг хийхэд хэрэглэнэ.

Тэмдэглэл

Зөвхөн судалгааны зориулалттай.Оношлогооны процедурт ашиглахгүй.

1. Ургамлын түүхий олшруулалт эсвэл шууд олшруулалтын хувьд систем, праймер, үйл ажиллагаа зөв эсэхийг баталгаажуулахын тулд туршилтыг эхлүүлэхийн өмнө цэвэршүүлсэн геномын ДНХ-ийг эерэг хяналт болгон ашиглахыг зөвлөж байна.

2. Энэхүү иж бүрдэлд ашигласан ДНХ полимеразын шууд олшруулалт нь хүчтэй засварлах үйл ажиллагаатай.Хэрэв ТТ клончлох шаардлагатай бол аденин нэмэхээс өмнө ДНХ-г цэвэршүүлэхийг зөвлөж байна.

3. Праймер дизайны заавар:

а.Праймерын 3′ төгсгөлийн хамгийн сүүлийн суурь нь G эсвэл C байх ёстой.

б.Праймерын 3′ төгсгөлийн сүүлийн 8 сууринд дараалсан таарахгүй байхаас зайлсхийх хэрэгтэй.в.Праймерын 3′ төгсгөлд үсний хавчаар хийхээс зайлсхий.

г.Урагшаа болон урвуу праймерын Tm утгын ялгаа нь 1℃-аас ихгүй байх ёстой бөгөөд Tm утгыг 60 ~ 72℃ болгон тохируулах шаардлагатай (Tm утгыг тооцоолохын тулд Primer Premier 5-ыг ашиглахыг зөвлөж байна).

д.Загвартай тохирохгүй нэмэлт праймер дарааллыг праймерын Tm утгыг тооцоолохдоо оруулах ёсгүй.

е.Праймерын GC агууламжийг 40% -60% байлгахыг зөвлөж байна.

g.Праймер дахь A, G, C, T-ийн нийт тархалт аль болох жигд байх ёстой.GC эсвэл AT агууламж өндөртэй бүс нутгийг ашиглахаас зайлсхий.

h.Праймер дотор эсвэл хоёр праймерын хооронд 5 ба түүнээс дээш суурийн нэмэлт дараалал байхаас зайлсхийж, хоёр праймерын 3′ төгсгөлд 3 ба түүнээс дээш суурийн нэмэлт дарааллаас зайлсхийх хэрэгтэй.

би.Өвөрмөц бус өсгөлтөөс урьдчилан сэргийлэхийн тулд праймерын өвөрмөц байдлыг шалгахын тулд NCBI BLAST функцийг ашиглана уу.