Hotstart Taq ДНХ полимераз
Hot Start Taq DNA Polymerase (эсрэгбиеийн өөрчлөлт) нь Thermus aquaticus YT-1-ийн халуунд тэсвэртэй ДНХ полимераз бөгөөд 5′→3′ полимеразын идэвхжил, 5′ флап эндонуклеазын идэвхжилтэй.Халуун эхлэлийн Taq ДНХ полимераз нь Taq ДНХ полимераз бөгөөд термолабил Taq эсрэгбиемүүдээр өөрчлөгддөг.Эсрэгбиеийн өөрчлөлт нь ПГУ-ын өвөрмөц байдал, мэдрэмж, гарцыг нэмэгдүүлсэн.
Бүрэлдэхүүн хэсгүүд
| Бүрэлдэхүүн хэсэг | HC1012A-01 | HC1012A-02 | HC1012A-03 | HC1012A-04 |
| 5 × HC Taq буфер | 4 × 1 мл | 4×10 мл | 4х50 мл | 5х400 мл |
| Халуун эхлэл Так ДНХ Полимераз (эсрэгбие өөрчлөгдсөн) (5 U/μL) | 0.1 мл | 1 мл | 5 мл | 10х5 мл |
Хэрэглээ
10 мм Tris-HCl (25℃ температурт рН 7.4), 100 мм KCl, 0.1 мм EDTA, 1 мм дитиотреитол, 0.5% Tween20, 0.5% IGEPALCA-630, 50% глицерол.
Хадгалах нөхцөл
0°С-аас доош температурт тээвэрлэж, -25°C~-15°C хэмд хадгална.
Нэгжийн тодорхойлолт
Нэг нэгж нь 75°С-т 30 минутын дотор 15 нмоль dNTP-ийг хүчилд уусдаггүй материалд оруулах ферментийн хэмжээг хэлнэ.
Чанарын шалгалт
1.Endонуклеазын үйл ажиллагаа:20 U ферментийг 4 мкг pUC19 ДНХ-тэй 4 цагийн турш 37 хэмд өсгөвөрлөхөд гель электрофорезоор тодорхойлогдсон ДНХ-ийн задрал илрээгүй.
2.5 кб Ламбда ПГУ:200 μM dNTP болон 0.2 мкМ праймерын дэргэд 1.25 нэгж Так ДНХ Полимераз бүхий 5 нг Ламбда ДНХ-ийн ПГУ-ын 25 цикл олшруулснаар хүлээгдэж буй 5 кб бүтээгдэхүүн гарна.
3.Экзонуклеазын үйл ажиллагаа:Хамгийн багадаа 12.5 U Так ДНХ Полимераз агуулсан 50 мкл-ийн урвалыг 10 нмоль 5´-FAM олигонуклеотид бүхий 37 хэмд 30 минутын турш өсгөвөрлөхөд илрэх задрал гарахгүй.
4.RNase үйл ажиллагаа:20 U фермент агуулсан 10 мкл урвалыг 1 мкг РНХ транскриптээр 2 цагийн турш 37 0С-т өсгөвөрлөсөн нь гель электрофорезоор тодорхойлогдсон РНХ-ийн задрал илрээгүй.
5.Дулаан идэвхгүйжүүлэх:Үгүй
Урвалын систем
| Бүрэлдэхүүн хэсгүүд | Эзлэхүүн |
| ДНХ-ийн загварa | сонголттой |
| 10 мкМ урагшлах праймер | 0.5 мкл |
| 10 мкм урвуу праймер | 0.5 мкл |
| dNTP холимог (тус бүр 10мМ) | 0.5 мкл |
| 5 × HC Taq буфер | 5 мкл |
| Так ДНХ полимеразб(5U/μл) | 0.125 мкл |
| Нуклеазгүй ус | 25 мкл хүртэл |
Тэмдэглэл:
1) а.
| ДНХ | Дүн |
| Геном | 1 нг-1 мкг |
| Плазмид эсвэл вирус | 1 хуудас-1 нг |
2) б.Так ДНХ Полимеразын оновчтой концентраци нь тусгай хэрэглээнд 5-50 нэгж/мл (0.1-0.5 нэгж/25 мкл урвал) хооронд хэлбэлзэж болно.
Дулааны дугуйн протокол
ПГУ
| Алхам | Температур(°C) | Цаг хугацаа | Цикл |
| Анхны денатурациa | 95 ℃ | 1-3 мин | - |
| Денатураци | 95 ℃ | 15-30 секунд | 30-35 мөчлөг |
| Хатаахб | 45-68 ℃ | 15-60 секунд | |
| Өргөтгөл | 68 ℃ | 1кб/мин | |
| Эцсийн өргөтгөл | 68 ℃ | 5мин | - |
Тэмдэглэл:
1) Ихэнх олшруулалтад 95°С-т 1 минутын анхны денатураци хангалттай.Хэцүү загваруудын хувьд 95°С-т 2-3 минутын урт денатураци хийхийг зөвлөж байна.Колонийн ПГУ-ын хувьд эхний 5 минутын турш 95 хэмд денатураци хийхийг зөвлөж байна.
2) Цэвэрлэх үе шат нь ихэвчлэн 15-60 секунд байдаг.Хатаах температур нь хос праймерын Tm дээр суурилдаг бөгөөд ихэвчлэн 45-68 ℃ байдаг.
