Протеиназа К (шингэн)
Муурын дугаар: HC4502A
Proteinase K нь өргөн субстратын өвөрмөц шинж чанартай тогтвортой серин протеаз юм.Энэ нь угаалгын нунтаг байгаа ч гэсэн төрөлх төлөв байдалд олон уургийг задалдаг.Кристал болон молекулын бүтцийн судалгаагаар фермент нь идэвхтэй талбайн каталитик гурвал (Asp) бүхий субтилизин гэр бүлд хамаардаг болохыг харуулж байна.39- Түүний69- Сэр224).Хагарлын зонхилох газар нь блоклогдсон альфа амин бүлгүүдтэй алифат болон үнэрт амин хүчлүүдийн карбоксил бүлгийн зэргэлдээ пептидийн холбоо юм.Энэ нь өргөн хүрээний хувьд ихэвчлэн ашиглагддагөвөрмөц байдал.
Тодорхойлолт
| Гадаад төрх | Өнгөгүй цайвар хүрэн шингэн |
| Үйл ажиллагаа | ≥800 U/мл |
| Уургийн концентраци | ≥20 мг/мл |
| ДНаз | Аль нь ч илрээгүй |
| RNase | Аль нь ч илрээгүй |
Хадгалах нөхцөл
2-8 хэмийн температурт хадгална.
Үл хөдлөх хөрөнгө
| EC дугаар | 3.4.21.64 (РTritirachium цомгийн ecombinant) |
| Молекулын жин | 29 кДа (SDS-PAGE) |
| Изоэлектрик цэг | 7.81 |
| Хамгийн оновчтой рН | 7.0-12.0 Зураг 1 |
| Хамгийн оновчтой температур | 65 ℃ Зураг 2 |
| рН-ийн тогтвортой байдал | рН 4.5-12.5 (25℃, 16 цаг) Зураг 3 |
| Дулааны тогтвортой байдал | 50℃-аас доош (рН 8.0, 30 минут) Зураг 4 |
| Идэвхжүүлэгчид | SDS, мочевин |
| Дарангуйлагчид | Диизопропил фторфосфат;фенилметилсульфонил фтор |
Хэрэглээ
1. Генетикийн оношлогооны иж бүрдэл
2. РНХ ба ДНХ олборлох иж бүрдэл
3. Эд эсээс уургийн бус бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг гаргаж авах, ДНХ-ийн вакцин зэрэг уургийн хольцыг задлах, гепарин бэлтгэх
4. Импульсийн электрофорезийн аргаар хромосомын ДНХ бэлтгэх
5. Баруун толбо
6. In vitro оношлогоонд ферментийн гликозилжүүлсэн альбумин урвалжууд
Урьдчилан сэргийлэх
Ашиглах, жинлэх үед хамгаалалтын бээлий, нүдний шил зүүж, хэрэглэсний дараа агааржуулалт сайтай байлгана.Энэ бүтээгдэхүүн нь арьсны харшлын урвал, нүдийг цочрооход хүргэдэг.Хэрэв амьсгалсан бол харшил, астма, амьсгал давчдах шинж тэмдэг илэрч болно.Амьсгалын замын цочрол үүсгэж болзошгүй.
Шинжилгээ
Нэгжийн тодорхойлолт
Нэг нэгж (U) нь дараах нөхцлүүдийн дагуу минутанд 1 мкмоль тирозин үүсгэхийн тулд казеиныг гидролиздэхэд шаардагдах ферментийн хэмжээг хэлнэ.
Урвалж бэлтгэх
Урвалж I: 1г сүүний казеиныг 50мл 0.1М натрийн фосфатын уусмалд (рН 8.0) уусгаж, 65-70 ℃ усанд 15 минутын турш өсгөвөрлөж, хутгаж, уусгаж, усаар хөргөж, натрийн гидроксидоор рН8.0 хүртэл тохируулж, бэхэлсэн. хэмжээ 100 мл.
Урвалж II: TCA уусмал: 0.1М трихлорацетик хүчил, 0.2М натрийн ацетат, 0.3М цууны хүчил.
Урвалж III: 0.4M Na2CO3шийдэл.
Урвалж IV: Forint урвалжийг 5 удаа цэвэр усаар шингэлнэ.
Урвалж V: Фермент шингэрүүлэгч: 0.1М натрийн фосфатын уусмал (рН 8.0).
Урвалж VI: Тирозин уусмал: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 умол/мл тирозиныг 0,2М HCl-ээр уусгана.
Процедур
1. 0.5мл урвалж I-г 37℃ хүртэл урьдчилан халааж, 0.5мл ферментийн уусмал нэмээд сайтар хольж, 37℃-т 10 минутын турш өсгөвөрлөнө.
2. Урвалыг зогсоохын тулд 1 мл урвалж II нэмээд сайтар хольж, 30 минутын турш инкубацийг үргэлжлүүлнэ.
3. Центрифуг хийх урвалын уусмал.
4. 0.5мл дээд давхаргыг авч, 2.5мл урвалж III, 0.5мл урвалж IV нэмээд сайтар хольж, 37℃-т 30 минутын турш өсгөвөрлөнө.
5. ОД660ОД гэж тодорхойлсон1;хоосон хяналтын бүлэг: 0.5мл урвалж V-ийг OD тодорхойлохын тулд ферментийн уусмалыг орлуулахад ашигладаг660ОД гэж2, ΔOD=OD1-ОД2.
6. L-тирозин стандарт муруй: 0.5мл өөр концентрацитай L-тирозин уусмал, 2.5мл урвалж III, 0.5мл урвалж IV 5мл центрифугийн хоолойд, 37℃-т 30 минутын турш өсгөвөрлөж, OD-ийг илрүүлнэ.660L-тирозины өөр өөр концентрацийн хувьд Y=kX+b стандарт муруйг олж авсан бөгөөд Y нь L-тирозины концентраци, X нь OD юм.600.
Тооцоолол
2: Урвалын уусмалын нийт эзэлхүүн (мл)
0.5: Ферментийн уусмалын хэмжээ (мл)
0.5: Хромогенийг тодорхойлоход ашигласан шингэний урвалын хэмжээ (мл)
10: Урвалын хугацаа (мин)
Df: Олон дахин шингэлэх
C: Ферментийн концентраци (мг/мл)
Лавлагаа
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Биофиз.Res.Коммун.(1971);44:513.
3. Хилз, Х.болон бусад.евро.J. Биохим.(1975);56:103–108.
4. Самбрук Жet бусад, Молекулын клонжуулалт: Лабораторийн гарын авлага, 2-р хэвлэл, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Зураг
Зураг. 1 Хамгийн оновчтой pH
100мМ буфер уусмал: рН6.0-8.0, Na-фосфат;pH8.0- 9.0, Tris-HCl;рН9.0-12.5, Глицин-NaOH.Ферментийн концентраци:1мг/мл
Зураг 2 Хамгийн оновчтой температур
20мМ К-фосфатын буфер дэх урвал рН 8.0.Ферментийн концентраци: 1 мг/мл
Зураг 3 рН Тогтвортой байдал
25℃, 50мМ буфер уусмалаар 16 цаг эмчилгээ: рН 4.5-5.5, ацетат;рН 6.0-8.0, Na-фосфат;рН 8.0-9.0, Tris-HCl.рН 9.0-12.5, Глицин-NaOH.Ферментийн концентраци: 1 мг/мл
Зураг 4 Дулааны тогтвортой байдал
50мМ Tris-HCl буфер, рН 8.0 бүхий 30 минутын эмчилгээ.Ферментийн концентраци: 1 мг/мл
Зураг 5 Хадгалалт тогтвортойty at 25℃
