Урацил ДНХ гликозилаза
Uracil-DNA Glycosylase (UNG эсвэл UDG) нь 25 кДа молекул жинтэй E.coli-ийн рекомбинант клон юм.Энэ нь урацил агуулсан нэг ба хоёр судалтай ДНХ-ээс чөлөөт урацилыг ялгаруулж, РНХ-ийн эсрэг идэвхгүй бөгөөд ПГУ-ын олшруулалтын бүтээгдэхүүнийг бохирдуулахаас сэргийлэхэд ашиглаж болно.Үйлдлийн зарчим нь хэрэв ПГУ-ын урвалд dUTP-ийг dTTP-ээр орлуулж, dU суурь агуулсан ПГУ-ын олшруулалтын бүтээгдэхүүн үүссэн бол фермент нь нэг судалтай ба хоёр судалтай U суурийн гликозидын холбоог сонгомлоор тасалж чаддагт суурилдаг. ДНХ ба ПГУ-ын олшруулах бүтээгдэхүүнийг доройтуулна.
Санал болгож буй програм
Бохирдлоос урьдчилан сэргийлэх олшруулалт
Хадгалах нөхцөл
-20°С-д удаан хугацаагаар хадгалах, хэрэглэхийн өмнө сайтар хольж, хөлдөөх, гэсгээхээс зайлсхийх хэрэгтэй.
Хадгалах буфер
20 мм Tris-HCl (рН 8.0), 150 мм NaCl, 1 мм EDTA, 1 мм DTT, тогтворжуулагч, 50% глицерин.
Нэгжийн тодорхойлолт
dU суурь агуулсан 1 μг нэг хэлхээтэй ДНХ-ийг 37°С-т 1 цагийн дотор задлахад шаардагдах ферментийн хэмжээ 1 нэгж байна.
Чанарын шалгалт
1.SDS-PAGE электрофоретик цэвэршилт 98%-иас дээш
2.Олшруулалтын мэдрэмж, багцаас багцын хяналт, тогтвортой байдал
3.1U UNG-ийг 50℃ температурт 2 минутын турш боловсруулсны дараа 103 хувиас доош U агуулсан загвар бүрэн доройтож, олшруулах бүтээгдэхүүн гарахгүй.
4.Экзоген нуклеазын идэвхжил байхгүй
Зааварчилгаа
| Бүрэлдэхүүн хэсгүүд | Эзлэхүүн (μл) | Эцсийн төвлөрөл |
| 10 × ПГУ-ын буфер (dNTP агуулаагүй, Mg²+үнэгүй) | 5 | 1× |
| dUTPs (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 мкм |
| dUTP (dTTP солих) | - | 200-600 мкМ |
| 25 мМ MgCl2 | 2-8 мкл | 1-4 мм |
| 5 U/μL Так | 0.25 | 1.25 U |
| 5 U/μL UNG | 0.25 (0.1-0.5) | 0.25 U (0.1-0.5) |
| 25 × Праймер хольца | 2 | 1× |
| Загвар | - | ＜1мкг / урвал |
| ddH₂O | 50 хүртэл | - |
Жич: a: Хэрэв qPCR/qRT-PCR-д ашигласан бол флюресцент мэдрэгчийг урвалын системд нэмнэ.Ихэвчлэн праймерын эцсийн концентраци 0.2 μM нь сайн үр дүнг өгдөг;урвалын гүйцэтгэл муу үед праймерын концентрацийг 0.2-1 μM-ийн хүрээнд тохируулж болно.Ихэвчлэн датчикийн концентрацийг 0.1-0.3 μM-ийн хүрээнд оновчтой болгодог.Праймер болон датчикийн хамгийн сайн хослолыг олохын тулд концентрацийн градиент туршилтыг хийж болно.
Тэмдэглэл
1.UNG ферментийг ПГУ-ын олшруулах урвалын өмнө урвалын системээс бохирдсон dUTP олшруулах бүтээгдэхүүнийг зайлуулж, улмаар бүтээгдэхүүний бохирдлын улмаас хуурамч эерэг үр дүнг гаргахгүйн тулд ашиглаж болно.
2.Бохирдлын эсрэг ПГУ-ын урвалд ашиглах UNG ферментийн оновчтой температур нь ерөнхийдөө 2 минутын турш 50℃;идэвхгүй болгох нөхцөл нь 5 минутын турш 95℃ байна.
3.Байнга хөлдөөх, гэсэхээс зайлсхийж, температурын их хэлбэлзэлд өртөхгүй байх.
4.Олшруулж буй генүүд нь dUTP-ийн ашиглалтын үр ашиг, UNG ферментийн мэдрэмтгий чанар өөр өөр байдаг тул UNG системийг ашигласнаар илрүүлэх мэдрэмж буурч байвал урвалын системийг тохируулж, оновчтой болгох шаардлагатай бөгөөд хэрэв танд техникийн дэмжлэг хэрэгтэй бол холбоо барина уу. манай компани.
