ДНХ олборлох мини хэрэгсэл
Энэхүү иж бүрдэл нь оновчтой буфер систем ба цахиурт гель багана цэвэршүүлэх технологийг ашигладаг бөгөөд энэ нь TAE эсвэл TBE агароз гелийн янз бүрийн концентрациас 70 bp - 20 kb ДНХ-ийн хэлтэрхийг сэргээх боломжтой.ДНХ шингээх багана нь давс ихтэй нөхцөлд ДНХ-г тусгайлан шингээж чаддаг.Нэмж дурдахад уг хэрэгсэл нь ПГУ-ын бүтээгдэхүүн, ферментийн урвалын систем эсвэл бусад аргаар олж авсан түүхий ДНХ-ийн бүтээгдэхүүнээс ДНХ-ийн хэсгүүдийг шууд цэвэрлэж, уураг, бусад органик нэгдлүүд, органик бус давсны ионууд, олигонуклеотидын праймерууд гэх мэт хольцыг арилгах боломжтой.Энэ нь цэвэршүүлэлтийг 10-15 минутын дотор дуусгах боломжтой.Цэвэршүүлсэн ДНХ-ийг шууд холбох, хувиргах, фермент задлах, in vitro транскрипц, ПГУ, дараалал тогтоох, бичил тарилга хийх гэх мэт үйл ажиллагаанд ашиглаж болно.
Хадгалах нөхцөл
-15 ~ -25 хэмд хадгалж, тасалгааны температурт тээвэрлэнэ.
Бүрэлдэхүүн хэсгүүд
| Бүрэлдэхүүн хэсгүүд | (100 rxns) |
| Буфер ДНБ | 80 мл |
| Буфер GW | 2х20 мл |
| Элюцийн буфер | 20 мл |
| FastPure DNA Mini Columns-G | 100 |
Буферийн ДНБ:ДНХ холбогч буфер.
Буфер GW:Угаалгын буфер;Хэрэглэхийн өмнө лонхонд заасан хэмжээгээр үнэмлэхүй этилийн спирт нэмнэ.
Элюцийн буфер:Элюци.
FastPure DNA Mini Columns-G:ДНХ шингээх багана.
Цуглуулгын хоолой 2 мл:Шүүгдсийг цуглуулах хоолой.
Бэлтгэсэн материал
1.5 мл ариутгасан хоолой, абсолют этанол ба изопропанол (ДНХ-ийн фрагмент ≤100 bp үед 1 хэмжээ нэмнэ)
изопропанолыг 1 эзэлхүүнтэй гель), усан банн.
Туршилтын үйл явц
Хэрэглэхийн өмнө шошгон дээр заасан буфер GW шингэлэхийн тулд 80 мл этилийн спирт нэмж, өрөөний температурт хадгална.
Механизм
1. ПГУ-ын урвалын уусмал
Гель олборлох схем: Тэнцүү эзэлхүүнтэй буферийн GDP ПГУ-ын урвалын уусмалыг сэргээх схемийг нэмнэ:5 дахин их хэмжээний буфер нэмнэ
2. ДНБ Гель-ийн эзэлхүүнийг тооцоол (100 μл 100 мг-тай тэнцүү)
Гель уусгана
3. 50 ~ 55 хэмд урьдчилан халаана℃
4. Боолт угаах
300 мкл буферийн ДНБ* нэмнэ
700 мкл буфер ГВт нэмнэ
700 мкл буфер ГВт нэмнэ
5. Элут
20 – 30 мкл уусмалын буфер эсвэл ионгүйжүүлсэн ус нэмнэ
Тэмдэглэл* ПГУ-ын урвалын шингэнийг энэ алхамгүйгээр сэргээх
Гель олборлох програм
1. ДНХ электрофорезийн дараа ДНХ-ийн фрагментийг хуваахдаа хэт ягаан туяаны гэрлийн дор агароз гелээс ДНХ-ийн фрагментийн нэг судалтай хэсгийг хасна.Гельний харагдахуйц чийгийг шингээхийн тулд шингээгч цаас ашиглахыг зөвлөж байна, аль болох нэмэлт агарозыг арилгах замаар гель зүсмэлийн хэмжээг багасгах.Хэмжээг нь тооцоолохын тулд гель зүсмэлийг (микроцентрифугийн хоолойгүй) жинлэнэ үү: 100 мг гель зүсмэлийн хэмжээ нь 1г/мл нягттай гэж үзвэл ойролцоогоор 100 мкл байна.
2. Тэнцүү эзэлхүүнтэй буфер ДНБ-ийг нэмж, 50~55℃ температурт 7-10 минутын турш өсгөвөрлөнө (гелийн хэмжээнээс хамааран гель бүрэн уусах хүртэл инкубацийн хугацааг тохируулна).Инкубацийн үед хоолойг 2 удаа эргүүлнэ.
Δ Буферийн ДНБ-ийг 1-3 боть нэмэх нь ДНХ-ийн нөхөн сэргээх үр ашигт нөлөөлөхгүй.Хэрэв ДНХ-ийн хэлтэрхий 100 bp-ээс бага байвал буферийн ДНБ-ийг 3 боть нэмэх шаардлагатай;гель зүсмэлийг бүрэн уусгасны дараа 1 эзэлхүүн изопропанол нэмээд сайтар холино, дараа нь дараагийн алхам руу үргэлжлүүлнэ.
3. Дээжийг хоолойн ёроолд хүргэхийн тулд богино хугацаанд центрифуг хийж, FastPure DNA Mini Columns-G-г 2 мл цуглуулах хоолойд хийж, уусмалыг өдөрт нэг удаа дээд тал нь 700 мкл болгоомжтой шилжүүлнэ.
шүүлтүүрийн баганууд хүртэл 12,000 эрг / мин (13,800 X г) 30-60 секундын турш центрифуг хийнэ.
4. Шүүгдсийг хаяж, баганад 300 мкл буферийн ДНБ нэмж, тасалгааны температурт 1 минут өсгөвөрлөж, 12,000 эрг / мин (13,800 X г) 30-60 секундын турш центрифуг хийнэ.
5. Шүүгдсийг хаяж, баганад 700 мкл Buffer GW (үнэмлэхүй этанол нэмсэн эсэхийг шалгана уу!) нэмж, 12,000 эрг/мин (13,800 X г) 30-60 секундын турш центрифуг хийнэ.
Δ Хоолойн хананд наалдсан давсыг бүрэн угаахын тулд шингээх баганын хананд Buffer GW нэмнэ, эсвэл Buffer GW арын тагийг нэмээд 2-3 удаа эргүүлж холино.
6. 5-р алхамыг давт.
Δ GW буферээр хоёр удаа угаах нь давсыг бүрэн арилгаж, дараагийн туршилтуудад үзүүлэх нөлөөллийг арилгах боломжтой.
7. Шүүгдсийг хаяж, хоосон баганыг 12,000 эрг / мин (13,800 X г) 2 минутын турш центрифуг хийнэ.
8. Баганаыг цэвэр 1.5 мл микроцентрифугийн хоолойд хийж, баганын мембраны голд 20 - 30 мкл Элюцийн буфер нэмж, 2 минутын турш өсгөвөрлөсний дараа 12,000 эрг / мин (13,800 X г) хурдтайгаар 1 минутын турш центрифуг хийнэ.Баганыг хаяж, авсан ДНХ-ийг -20 хэмд хадгална.
Δ 8-р алхамын супернатантыг дахин ялгахын тулд багана руу шилжүүлж, шүүрүүлэх буферийг 55 хүртэл (ДНХ-ийн фрагмент >3 кб үед) урьдчилан халаах нь нөхөн сэргээх үр ашгийг нэмэгдүүлэхэд тустай байж магадгүй юм.
ПГУ-ын бүтээгдэхүүнийг сэргээх хөтөлбөр
Энэхүү протокол нь ПГУ-ын бүтээгдэхүүн, ферментийн урвалын систем болон бусад ДНХ-ийн түүхий бүтээгдэхүүнээс (удамшлын ДНХ орно) ДНХ-ийн хэсгүүдийг цэвэрлэхэд хамаарна.Энэхүү уусмал нь янз бүрийн нуклеотид, праймер, праймер димер, давсны молекул, фермент болон бусад хольцыг үр дүнтэй арилгаж чадна.
1. ПГУ-ын бүтээгдэхүүн, ферментийн урвалын уусмал болон бусад ДНХ-ийн түүхий бүтээгдэхүүнийг богино хугацаанд центрифуг хийнэ.Пипеткээр тэдгээрийн хэмжээг тооцоолж, ариутгасан 1.5 мл эсвэл 2 мл хоолой руу шилжүүлнэ.ddH2O-ийг 100 мкл хүртэл эзэлхүүн хүртэл нэмнэ;Харин өндөр концентрацитай геномын ДНХ-ийн хувьд ddH2O-ээр 300 мкл хүртэл шингэлэх нь нөхөн сэргээх үр ашгийг дээшлүүлэхэд тусална.
2. Буферийн ДНБ-ий 5 хэмжээг нэмж, эргүүлэх буюу эргүүлэх замаар сайтар холино.Хэрэв сонирхож буй ДНХ-ийн фрагмент 100 bp-ээс их байвал этанолын нэмэлт 1.5 боть (дээж + буферийн ДНБ) нэмэх шаардлагатай.
3. Баганыг буцааж цуглуулах хоолойд хийж, хольцыг баганад шилжүүлж, 12,000 эрг / мин (13,800 × г) 30-60 секундын турш центрифуг хийнэ.Холимог уусмалын эзэлхүүн >700 мкл бол шингээх баганыг дахин цуглуулах хоолойд хийж, үлдсэн уусмалыг шингээх багана руу шилжүүлж, 12,000 эрг / мин (13,800 × г) 30-60 секундын турш центрифуг хийнэ.
4. Дараагийн гүйцэтгэл нь 08- 1/Гел олборлох хөтөлбөрийн 5 – 8-р алхамыг хэлнэ.
Хэрэглээ
TAE эсвэл TBE агароз гелийн янз бүрийн концентраци;Төрөл бүрийн аргаар олж авсан ПГУ-ын бүтээгдэхүүн, ферментийн урвалын систем эсвэл бусад түүхий ДНХ-ийн бүтээгдэхүүн.Сэргээгдсэн хэлтэрхийнүүд нь70 bp -20 кб.
Тэмдэглэл
Зөвхөн судалгааны зориулалттай.Оношлогооны процедурт ашиглахгүй.
1. Хэрэглэхийн өмнө шошгон дээр заагдсан буфер GW шингэлэхийн тулд 80 мл этилийн спирт нэмж, өрөөний температурт хадгална.
2. Буферийн ДНБ-ийг бага температурт хадгалах үед тунадасжуулахад хялбар бол хэрэглэхээс өмнө тодорхой хугацааны турш тасалгааны температурт байрлуулж болно.Шаардлагатай бол 37 хэмийн усан ваннд тунадас бүрэн уусах хүртэл халааж, хольсны дараа хэрэглэж болно.
3. Усан банны температурыг 50 ~ 55℃ хүртэл урьдчилан тохируулна.
4. 08-1/Гель олборлох хөтөлбөрийн 1-р алхамд гель зүсмэлийн хэмжээг багасгах нь уусах хугацааг мэдэгдэхүйц бууруулж, нөхөн сэргээх үр ашгийг нэмэгдүүлэх болно (Шугаманжсан ДНХ нь өндөр температурт тасралтгүй өртөхөд амархан гидролиз болдог).Хэт ягаан туяа нь ДНХ-ийн гэмтэл учруулж болзошгүй тул ДНХ-ийн гельийг хэт ягаан туяанд удаан байлгаж болохгүй.
5. 08-1/Гель олборлох хөтөлбөрийн 2-р алхамд гелийг бүрэн уусгана, эс тэгвээс ДНХ-ийн нөхөн сэргээх үр ашигт ноцтой нөлөөлнө.
6. Элюцийн буфер буюу ddH2O-г 55℃ хүртэл урьдчилан халаах нь ДНХ-ийн шингээлтийн үр ашгийг дээшлүүлэхэд тустай.ДНХ-ийг 2.5 мМ Tris-HCl, рН 7.0 – 8.5-ийн элюент дотор хадгалахыг зөвлөж байна.
